樊留博，劉寶華，章霞，盧戰(zhàn)，田瑛，王靈芝，馬利中

（1.溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院 康復科，浙江 臺州 317000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

電針聯(lián)合強制性運動對腦缺血大鼠GAP-43和GFAP表達的影響

樊留博1，劉寶華2，章霞1，盧戰(zhàn)1，田瑛1，王靈芝1，馬利中1

（1.溫州醫(yī)科大學附屬臺州醫(yī)院 康復科，浙江 臺州 317000；2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 康復科，浙江 溫州 325027）

目的：通過觀察電針聯(lián)合強制性運動對局灶性腦缺血大鼠灶周生長相關(guān)蛋白-43（GAP-43）及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達的影響，探討腦缺血后電針聯(lián)合強制性運動療法促進神經(jīng)功能恢復的作用及機制。方法：將SD雄性大鼠采用線栓法制作大腦中動脈阻塞（MCAO）局灶性腦缺血模型，隨機平均分為模型組、強制性運動（CIMT）組、電針組和電針聯(lián)合CIMT組，每組以7、14、21、28和35 d為時間點再隨機平均分為5個亞組，同時設立假手術(shù)組。分別行相應治療，以Morris水迷宮試驗進行神經(jīng)功能評價，分別于相應時間點取腦采用免疫組織化學方法觀察每個時間點腦梗死灶周圍GAP-43、GFAP陽性細胞數(shù)，Western blot法檢測腦組織GAP-43、GFAP蛋白表達。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與模型組比較，CIMT組和電針組潛伏期和穿臺次數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；電針聯(lián)合CIMT組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著低于模型組，也顯著低于CIMT組和電針組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；電針組與CIMT組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組進行比較，在14、21、28 d時電針聯(lián)合CIMT組GAP-43表達顯著上調(diào)，而GFAP表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且電針聯(lián)合CIMT組GAP-43陽性細胞數(shù)多于CIMT組和電針組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；電針聯(lián)合CIMT組GFAP陽性細胞數(shù)少于CIMT組和電針組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在35 d缺血區(qū)周圍GAP-43表達增加、GFAP表達減少，但與CIMT組和電針組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：電針聯(lián)合CIMT可促進腦梗死灶周圍GAP-43的表達，抑制GFAP的表達，從而改善大鼠神經(jīng)功能。

電針；強制性運動；腦梗死；生長相關(guān)蛋白-43；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；大鼠

腦梗死患者存活中約有90%遺留有不同程度的神經(jīng)功能障礙，如偏癱、失語等。神經(jīng)細胞損傷后的功能恢復是神經(jīng)疾病治療的關(guān)鍵。因此早期客觀評估神經(jīng)功能障礙的嚴重程度并給予積極的治療對患者的功能康復至關(guān)重要。電針聯(lián)合強制性運動（constraint-induced movement therapy，CIMT）可改善腦卒中患者神經(jīng)功能的康復，但其作用機制尚不清楚。目前研究表明星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)可塑性及神經(jīng)再生方面與膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibeillary acid protein，GFAP）和生長相關(guān)蛋白-43（growth associated protein，GAP-43）表達密切相關(guān)[1-2]。本實驗通過觀察電針聯(lián)合CIMT對局灶周圍腦組織GAP-43和GFAP表達的影響，探討電針聯(lián)合CIMT促進腦卒中運動功能恢復的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 GAP-43和GFAP多克隆抗體（購自上海西寶生物科技有限公司）；TRITC標記的二抗（購自武漢博士德生物工程有限公司）。華佗牌針灸針（0.25 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品有限公司）。健康雄性SD大鼠200只（體質(zhì)量220～270 g，購自浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心[許可證號SCXK（浙）20080033]）。

1.2 造模方法 采用栓線法制作大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型，參照Longa法[3]并加以改良。將大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉（劑量為0.35 mL/100 g）后仰臥固定在手術(shù)臺上。切開大鼠頸部正中皮膚及淺筋膜，鈍性分離胸鎖乳突肌與胸骨舌骨肌，分別分離左側(cè)頸總動脈及頸外動脈、頸內(nèi)動脈，將魚線線栓頭用硅膠包裹，用制備好的魚線沿頸外動脈插至頸內(nèi)動脈。動物清醒后采用Bederson法進行神經(jīng)功能缺損評分，評分1～3分者為模型成功。

1.3 動物分組與處理方法 造模成功后隨機分為模型組、CIMT組、電針組和電針聯(lián)合CIMT組各40只，各組再隨機分為術(shù)后7、14、21、28和35 d時處死5個亞組，每組8只。同時設立假手術(shù)組，除不插線外，余步驟同其他各組。模型組和假手術(shù)組動物自然飼養(yǎng)，不作特殊處理。其他各組分別行相應治療。其中CIMT組于造模成功后第2天將大鼠麻醉后健側(cè)于屈曲位用石膏繃帶固定，實行每天30 min電動跑臺CIMT。電針組于造模結(jié)束且動物尚未清醒時即開始針刺治療，穴位選用“百會”、“水溝”，定位參照“實驗動物穴位標準”來確定。以30號1寸毫針斜刺“百會”0.8寸，直刺“水溝”0.5寸。將針柄分別連接到G6805電針儀上，采用頻率為40 Hz的連續(xù)波，刺激強度以大鼠四肢肌肉輕微抖動、安靜耐受為度，時間20 min，每天1次。電針聯(lián)合CIMT組于電針治療結(jié)束后行CIMT訓練，具體的相關(guān)治療參數(shù)和方法與電針組和CIMT組相同。

1.4 Morris水迷宮試驗 參照Morris水迷宮法進行定向航行實驗和空間探索實驗，定向航行實驗評估空間學習能力，空間探索實驗評估空間記憶能力，在第1～第5天進行定向航行實驗，即每日將大鼠在同一象限入水點靠池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)大鼠從入水到爬上對角線象限站臺所需的時間，即逃避潛伏期以及搜索距離，每只大鼠每天訓練2次；第6天進行空間探索實驗，即撤去站臺將大鼠從原入水點放入水池，記錄120 s內(nèi)大鼠在原站臺象限游泳的時間。

1.5 GAP-43和GFAP免疫組織化學檢測方法 將各組大鼠經(jīng)心臟用多聚甲醛灌流固定，取腦固定脫水，石蠟包埋。腦組織放于-20 ℃冰箱中，冷凍20 min，取出后行連續(xù)冠狀切片5片，置于1% TTC磷酸緩沖液中，37 ℃下恒溫避光孵育20 min，腦片置于4%多聚甲醛固定，組織切片脫蠟脫水，免疫組織化學SP法檢測GAP-43、GFAP，DAB顯色。由另一觀察者在不知分組情況下每只動物選取3張切片在400倍視野下計數(shù)GAP-43、GFAP陽性細胞數(shù)，取其平均值。

1.6 GAP-43和GFAP的Western blot檢測方法 將各組大鼠處死切取梗死部分置于-80 ℃的冰箱內(nèi)保存，進行組織中總蛋白的提取，置于-20 ℃保存，經(jīng)蛋白定量、轉(zhuǎn)膜、免疫反應、化學發(fā)光、顯影、定影和圖像分析后得出。

1.7 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料用表示，進行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮試驗結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。與模型組比較，CIMT組和電針組潛伏期和穿臺次數(shù)差距不大，電針聯(lián)合CIMT組潛伏期和穿臺次數(shù)顯著低于模型組，也顯著低于CIMT組和電針組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；電針組與CIMT組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1-2。

表1 各組大鼠Morris水迷宮潛伏期（n=8，，s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮潛伏期（n=8，，s）

與假手術(shù)組比：aP＜0.001；與模型組比：bP＜0.001；與CIMT組比：cP＜0.001；與電針組比：dP＜0.001

表2 各組大鼠Morris水迷宮穿臺次數(shù)（n=8，）

表2 各組大鼠Morris水迷宮穿臺次數(shù)（n=8，）

與假手術(shù)組比：aP＜0.001；與模型組比：bP＜0.001；與CIMT組比：cP＜0.001；與電針組比：dP＜0.001

2.2 各組大鼠不同時間點GAP-43和GFAP表達結(jié)果電針聯(lián)合CIMT組與模型組進行比較，在14、21、28 d時能夠顯著上調(diào)GAP-43表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且強于CIMT組和電針組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；在35 d缺血區(qū)周圍GAP-43表達增加，但與CIMT組和電針組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各治療組在各時間段GFAP表達均低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），電針聯(lián)合CIMT與CIMT組、電針組比較在造模后14、21和28 d缺血區(qū)周圍GFAP表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但在35 d時缺血區(qū)周圍GFAP表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3-6。

表3 各組大鼠在不同時間點腦缺血灶周圍GAP-43陽性細胞數(shù)（n=8，，個/cm2）

表3 各組大鼠在不同時間點腦缺血灶周圍GAP-43陽性細胞數(shù)（n=8，，個/cm2）

與模型組比：aP＜0.05；與CIMT組比：bP＜0.05；與電針組比：cP＜0.05

3 討論

目前治療腦梗死的藥物仍以改善腦微循環(huán)為主，急性期溶栓雖然有效，但卻受到時間窗（3～6 h）的限制，只有極少數(shù)腦梗死患者能夠獲得治療機會，大多數(shù)患者神經(jīng)功能缺失不可避免，因此目前研究促進大腦功能的重組和側(cè)支再生的方法，爭取最佳的康復時機，促進機體功能恢復，以減少殘疾發(fā)生是一種最佳的途徑。為了進一步了解電針聯(lián)合CIMT促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復的內(nèi)在機制，本研究建立腦梗死大鼠模型，以GAP-43、GFAP的表達為評價指標，深入研究電針聯(lián)合CIMT促進腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復的可能分子機制。

表4 各組大鼠在不同時間點腦缺血灶周圍GFAP陽性細胞數(shù)（n=8，，個/cm2）

表4 各組大鼠在不同時間點腦缺血灶周圍GFAP陽性細胞數(shù)（n=8，，個/cm2）

與模型組比：aP＜0.05；與CIMT組比：bP＜0.05；與電針組比：cP＜0.05

表5 各組大鼠在不同時間點腦缺血組織中GAP-43的Western blot檢測結(jié)果（n=8，）

表5 各組大鼠在不同時間點腦缺血組織中GAP-43的Western blot檢測結(jié)果（n=8，）

與模型組比：aP＜0.05；與CIMT組比：bP＜0.05；與電針組比：cP＜0.05

表6 各組大鼠在不同時間點腦缺血組織中GFAP的Western blot檢測結(jié)果（n=8，）

表6 各組大鼠在不同時間點腦缺血組織中GFAP的Western blot檢測結(jié)果（n=8，）

與模型組比：aP＜0.05；與CIMT組比：bP＜0.05；與電針組比：cP＜0.05

GAP-43又稱作neuromodulin，是一個軸突膜蛋白，是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細胞外生長及突觸發(fā)育形成和神經(jīng)細胞再生[4-5]。在神經(jīng)元發(fā)育和再生過程中高水平表達，調(diào)解軸突延伸作用，改變細胞形態(tài)。作為細胞內(nèi)信號，可大大增強與G蛋白偶聯(lián)的受體轉(zhuǎn)運作用。在局灶性腦缺血時，GAP-43蛋白質(zhì)持續(xù)性表達，并且與大鼠的行為學恢復密切相關(guān)。在腦損傷后的重塑過程中，GAP-43對神經(jīng)纖維生長、發(fā)育、再生以及突觸功能維持和遞質(zhì)釋放都起著重要作用；其不僅啟動軸突的生長，引導生長錐，而且是形成復雜而嚴密的神經(jīng)網(wǎng)絡所必需的[6]。故GAP-43蛋白成為提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性和再生能力的新靶點[7]。GFAP是Eng等從多發(fā)性側(cè)索硬化癥患者腦組織中提取的，它是一種星形膠質(zhì)細胞特異性的中間纖維蛋白，僅在成熟的星形膠質(zhì)細胞表達。在正常動物腦灰質(zhì)內(nèi)，用抗GFAP免疫組織化學檢測多數(shù)為陰性，神經(jīng)系統(tǒng)受到刺激或損傷后，星形細胞表現(xiàn)快速反應，其標志之一是GFAP的表達，因此目前將GFAP的表達與否作為星形細胞活動狀態(tài)的標志之一[8-9]。實驗證明，在GFAP缺如條件下小鼠對腦缺血損傷具有更高的敏感性[10-12]。本研究表明，模型組大鼠腦梗死灶周圍GAP-43及GFAP表達明顯升高，在缺血7 d達到高峰，以后逐漸下降，缺血35 d后逐漸達到穩(wěn)定水平，提示機體自身修復可能達到一個相對平衡狀態(tài)。我們在相同時間點進行了組間對比發(fā)現(xiàn)，電針聯(lián)合CIMT組在14、21、28 d的GAP-43表達明顯高于模型組、假手術(shù)組及其他治療組，而GFAP表達反而減少；說明GAP-43為腦損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)可塑性損傷修復的重要物質(zhì)，況且在缺血早期星形膠質(zhì)細胞能分泌GFAP，增強神經(jīng)元對腦缺血、低氧的耐受性，其對神經(jīng)元具有保護作用，促進其存活，隨著時間推移GFAP表達水平趨于穩(wěn)定狀態(tài)，電針聯(lián)合CIMT能夠通過促進腦梗死灶周圍GAP-43的表達，同時抑制GFAP的表達來提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自我修復能力；但CIMT組和電針組在35 d時GAP-43和GFAP表達結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義，提示CIMT干預和電針干預恢復的速度是一樣的。其進一步提示電針聯(lián)合CIMT療法促進神經(jīng)功能恢復的作用機制，可能是通過誘導細胞表達GAP-43、抑制GFAP表達，促進神經(jīng)軸突的再生，達到神經(jīng)功能重塑，改善星形膠質(zhì)細胞活性而實現(xiàn)的。

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(本文編輯：吳彬)

Effects of electroacupuncture and constraint-induced movement therapy on the expression of GAP-43 and GFAP after middle cerebral artery occlusion in rats

FAN Liubo1, LIU Baohua2, ZHANG Xia1, LU Zhan1,TIAN Ying1, WANG Lingzhi1, MA Lizhong1.
1.Department of Rehabilitation of Medical, Taizhou Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University, Taizhou, 317000; 2.Department of Rehabilitation, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To observe the change of electroacupuncture and CIMT on the neural function and the expression of GAP-43 and GFAP after middle cerebral artery occlusion in rats and investigate the effect of electroacupuncture and CIMT on the neural function. Methods: MCAO was established by nylon monoflament. These rats were randomly divided into 4 group: model group, CIMT group, electroacupuncture group, and electroacupuncture with CIMT group. Then each group was randomly divided into 5 subgroups by 7 d, 14 d, 21 d, 28 d, and 35 d. Meanwhile to design a sham-operation group. The corresponding treatment was performed respectively. The evaluations included the behavior scores and Morris water maze experiment, both was to compare the recovery of neural physiological function at different time points abovementioned. Immuno-histochemical technique was used to observe the positive cells of GAP-43 and GFAP in cortical ischaemic lesions of the rats in each group at different time points. The protein expression of GAP-43 and GFAP were detected by Western blot at day after ischemia. Results: The expression of GAP-43 in gray matter of rats were obviously increased in electroacupuncture with CIMT group compared with he model group, CIMT group, and acupuncture group after 14 d, 21 d, 28 d (P＜0.05), The expression of GFAP in gray matter of rats were obviously decreased in electroacupuncture withCIMT group compared with CIMT group, electroacupuncture group after 14 d, 21 d, 28 d (P＜0.05), but no significant difference was found between CIMT group and acupuncture therapy group after 35 d (P＞0.05). Conclusion: Electroacupuncture combined with CIMT can improve neurological function of focal cerebral ischemia rats, which may be associated with the increase of GAP-43 and descrease of GFAP in peri-infarct regions.

electroacupuncture; constraint-induced movement therapy; cerebral infarction; growth associated protein; glial fbeillary acid protein; rats

R493

ADOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.03.003

2014-06-03

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目（2012KYB238）；浙江省中醫(yī)藥科技計劃資助項目（2011ZB158）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計劃資助項目（2010KYB124）。

樊留博（1975-），男，陜西丹鳳人，副主任醫(yī)師，碩士。