李燕明，佟訓(xùn)靚，許宏濤，田埂，郎繼東，肖飛，蔡虻

（1.北京醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100730； 2.北京醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)部，北京 100730；3.北京醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100730；4.清華大學(xué) 生命科學(xué)院分析測試中心，北京 100084；5.衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730； 6.北京醫(yī)院 醫(yī)院感染管理處，北京 100730）

·技術(shù)與方法·

Illumina高通量測序技術(shù)檢測醫(yī)院內(nèi)空氣中微生物

李燕明1，6，佟訓(xùn)靚2，許宏濤3，田埂4，郎繼東4，肖飛5，蔡虻6

（1.北京醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100730； 2.北京醫(yī)院 老年醫(yī)學(xué)部，北京 100730；3.北京醫(yī)院 檢驗(yàn)科，北京 100730；4.清華大學(xué) 生命科學(xué)院分析測試中心，北京 100084；5.衛(wèi)生部老年醫(yī)學(xué)研究所，北京 100730； 6.北京醫(yī)院 醫(yī)院感染管理處，北京 100730）

目的：應(yīng)用Illumina高通量測序技術(shù)對醫(yī)院內(nèi)空氣環(huán)境進(jìn)行檢測，了解醫(yī)院內(nèi)不同科室空氣中常見微生物的分布特點(diǎn)。方法：利用恒流負(fù)壓收集器采集北京醫(yī)院門診、急診、外科監(jiān)護(hù)室、呼吸監(jiān)護(hù)室4個(gè)科室的空氣樣本，提取微生物DNA樣本，利用Illumina高通量測序技術(shù)分析不同科室空氣環(huán)境中微生物的種類和相對含量。結(jié)果：高通量測序的方法可一次性檢出上千種微生物，如真菌、細(xì)菌、病毒，其優(yōu)勢在于對真菌的鑒定。在外科監(jiān)護(hù)室、呼吸監(jiān)護(hù)室，致病性真菌占空氣中真菌的比例較高，分別為60.37%、81.59%，而在門診、急診，該比例稍低，分別為53.25%、58.98%。在真菌菌屬分類中，霉菌中的曲霉，酵母菌中的隱球菌和念珠菌所占比例較高。結(jié)論：高通量測序技術(shù)應(yīng)用于醫(yī)院環(huán)境監(jiān)測，可提供更多機(jī)會性感染的病原菌信息，對改進(jìn)醫(yī)院環(huán)境監(jiān)控的技術(shù)方法及提高醫(yī)院感染的監(jiān)控水平提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

高通量測序；醫(yī)院感染；曲霉；隱球菌；念珠菌

近年來，醫(yī)院感染發(fā)生率不斷增高?？諝鈧鞑ナ窃簝?nèi)感染傳播的重要途徑之一，但對醫(yī)院內(nèi)空氣中病原微生物的種類及分布情況的監(jiān)測是目前院內(nèi)感染研究的焦點(diǎn)與難點(diǎn)[1]。盡管缺乏空氣環(huán)境中某些病原微生物含量及種類的變化引發(fā)醫(yī)院相關(guān)性感染流行和暴發(fā)的因果關(guān)系的證據(jù)，但業(yè)內(nèi)公認(rèn)改善醫(yī)院環(huán)境空氣質(zhì)量可以減少醫(yī)院感染的發(fā)生和傳播[2]。傳統(tǒng)的醫(yī)院環(huán)境的監(jiān)測方法相對落后，而高通量測序等新技術(shù)不斷引入醫(yī)院感染監(jiān)測和防控，并逐步形成其理論體系是大勢所趨。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)對醫(yī)院內(nèi)空氣環(huán)境進(jìn)行檢測，了解醫(yī)院內(nèi)不同科室空氣中常見微生物的分布特點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 本研究利用恒流負(fù)壓收集器采集北京醫(yī)院門診、急診、外科監(jiān)護(hù)室、呼吸監(jiān)護(hù)室4個(gè)地點(diǎn)空氣樣本，提取富含空氣中微生物DNA的樣本，利用Illumina高通量測序技術(shù)分析北京醫(yī)院不同科室空氣環(huán)境中微生物的種類和相對含量等，探討醫(yī)院內(nèi)環(huán)境精確化、系統(tǒng)化的監(jiān)測方法[3]。本研究參照文獻(xiàn)[4]將真菌分為致病性真菌和非致病性真菌。

1.2 采樣時(shí)間和地點(diǎn) 2013年12月24日上午8∶00至次日上午8∶00，對門診、急診、外科監(jiān)護(hù)室、呼吸監(jiān)護(hù)室4個(gè)地點(diǎn)分別利用空氣沉降法和恒流負(fù)壓收集器對空氣環(huán)境的微生物進(jìn)行收集，對其中沉降法收集的微生物進(jìn)行培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定，而收集器收集的微生物提取DNA基因后進(jìn)行測序。

1.3 基因組DNA提取及擴(kuò)增 采用Powerfecal DNA Isolation Kit（MoBio，美國）試劑盒，參照說明書操作步驟，提取濾片上富集的微生物的總DNA。提取的總DNA采用REPLI-g? Single Cell Kit（Qiagen，Hilden，德國）進(jìn)行擴(kuò)增。4個(gè)不同地點(diǎn)的總DNA和空白對照組共同用StepOne的方法進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證（Life technologies，CA，美國）。所有DNA樣本均儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測序和質(zhì)量控制 文庫準(zhǔn)備試劑盒購于New England Biolabs（NEB，美國）。根據(jù)NEB文庫準(zhǔn)備的說明完成測序文庫的建立。應(yīng)用Illumina MiSeq聯(lián)合HiSeq 2000測序儀進(jìn)行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析 在如下網(wǎng)址上（URL∶http∶// metagenomics.anl.gov/linkin.cgi?project= 3756），將測序數(shù)據(jù)上傳至MR-RAST服務(wù)器端（http∶// metagenomics.anl.gov/）。在原始數(shù)據(jù)去除低質(zhì)量的序列后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算在97%的相似水平上每個(gè)樣本的操作分類單元數(shù)量，特定的分類單元代表某種特定物種，基于樣品測序產(chǎn)生的操作分類單元的結(jié)果繪制稀疏曲線。計(jì)算單個(gè)樣本的Alpha多樣性，指數(shù)越大表示該樣本中的物種越豐富。在不同分類水平上進(jìn)行豐度統(tǒng)計(jì)和聚類分析。

2 結(jié)果

2.1 空氣環(huán)境中不同檢測方法對微生物的檢出情況 傳統(tǒng)空氣沉降法及空氣培養(yǎng)法結(jié)果顯示，在門診未測出任何細(xì)菌、真菌；在急診檢測出4類細(xì)菌（微球菌屬、葡萄球菌屬、芽孢桿菌屬、棒狀桿菌屬），未檢測出真菌；在外科監(jiān)護(hù)室檢測出2類細(xì)菌（微球菌屬、芽孢桿菌屬），未檢測出真菌；在呼吸監(jiān)護(hù)室檢測出3類細(xì)菌（芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、不動桿菌屬），未檢測出真菌。可以看出，傳統(tǒng)空氣沉降法聯(lián)合空氣培養(yǎng)法檢出的微生物數(shù)量較少。而恒流負(fù)壓收集空氣微生物并運(yùn)用高通量基因測序的方法對空氣中微生物進(jìn)行檢測，檢出的微生物數(shù)量很多，不僅包括較多的細(xì)菌，還檢出了真菌以及少量DNA病毒。在呼吸監(jiān)護(hù)室，細(xì)菌總數(shù)占到微生物總數(shù)的86%，真菌占9%，病毒占5%；在外科監(jiān)護(hù)室，細(xì)菌總數(shù)占到微生物總數(shù)的81%，真菌占11%，病毒占8%；在急診，細(xì)菌總數(shù)占到微生物總數(shù)的82%，真菌占14%，病毒占4%；在門診，細(xì)菌總數(shù)占到微生物總數(shù)的88%，真菌占9%，病毒占3%。

2.2 空氣環(huán)境中真菌菌類的構(gòu)成情況 通過上述基因測序技術(shù)得到醫(yī)院內(nèi)不同地點(diǎn)的空氣環(huán)境中微生物的數(shù)據(jù)結(jié)果，雖然真菌在上述空氣環(huán)境的微生物中所占比例差別不大，但致病性真菌的比例明顯不同，在外科監(jiān)護(hù)室、呼吸監(jiān)護(hù)室，致病性真菌占空氣中真菌的比例較高，分別為60.37%、81.59%，而在人員及空氣流通性相對較好的門診、急診，該比例稍低，分別為53.25%、58.98%。

2.3 空氣環(huán)境中真菌菌種分類情況 本研究參照現(xiàn)行致病性真菌菌類分為：酵母菌、霉菌、雙相型真菌及類真菌。本研究檢測4個(gè)地點(diǎn)的空氣環(huán)境中，相對豐度比例最高的為霉菌，雙相型真菌含量次之，然后是酵母菌，而在類真菌菌類中只檢出了肺孢子菌，其相對豐度極低，見表1。

表1 空氣微生物中不同真菌菌類構(gòu)成情況（%）

2.4 空氣環(huán)境中酵母菌菌屬及霉菌菌屬的構(gòu)成情況 在4個(gè)地點(diǎn)的空氣環(huán)境中的霉菌菌屬里，曲霉屬的比例均排在第1位，曲霉屬中的煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、構(gòu)巢曲霉、白曲霉等均有檢出，其中煙曲霉的相對豐度在各個(gè)地點(diǎn)的真菌菌種的相對豐度排名中，均位于第1位；而非曲霉屬中，根霉、馬內(nèi)菲青霉等均有檢出。在酵母菌中，隱球菌屬檢出比例最高，其次為念珠菌屬。隱球菌中哥特隱球菌和新型隱球菌均有檢出，念珠菌屬中包含代表菌種白色念珠菌、熱帶念珠菌、季也蒙念珠菌等。見表2。

表2 不同科室霉菌菌屬構(gòu)成情況（%）

3 討論

空氣是疾病傳播的重要媒介，是醫(yī)院感染的主要傳播途徑[5]。從SARS和流感的流行看出，衛(wèi)生保健機(jī)構(gòu)可以成為病原爆發(fā)流行的放大器，因此，在醫(yī)療環(huán)境中實(shí)施有效的感染控制措施十分必要[2]。醫(yī)院空氣環(huán)境中病原微生物的種類和含量應(yīng)該成為醫(yī)院空氣微生物污染程度監(jiān)測的重要指標(biāo)。醫(yī)院環(huán)境空氣中微生物的數(shù)量及種類比一般環(huán)境多而復(fù)雜。目前針對空氣采樣常用的主要方法是自然沉降法。自然沉降法僅限于收集空氣中因重力作用而沉降下來的一部分微生物，而不能完成對懸浮微生物的監(jiān)測[5-6]。自然沉降法往往極少能夠提供真菌病原學(xué)方面的證據(jù)[2]。在本研究中，通過自然沉降法聯(lián)合空氣培養(yǎng)法，細(xì)菌的檢出數(shù)量較少，且未檢出真菌和病毒；而通過恒流負(fù)壓收集空氣微生物聯(lián)合高通量基因測序法，細(xì)菌的檢出數(shù)量明顯升高，且真菌和病毒均有一定數(shù)量的檢出。因此，新型的分子生物學(xué)檢測方法在真菌檢測上的優(yōu)勢突顯，具有在此領(lǐng)域應(yīng)用的前景。

空氣中微生物與感染的關(guān)系，更主要的是微生物的數(shù)量，且出現(xiàn)空氣中微生物監(jiān)測數(shù)量不準(zhǔn)或漏檢的情況，主要是由于空氣采集方法的問題，而非細(xì)菌鑒定手段的問題，比較自然沉降法和空氣采集法的監(jiān)測結(jié)果更能說明問題。

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，侵襲性操作的增加，廣譜抗生素的使用及社會的老齡化，醫(yī)院感染日益增加。全球在每時(shí)每刻都有超過140萬人因醫(yī)院感染而備受折磨。醫(yī)院感染不僅僅是一個(gè)復(fù)雜的醫(yī)療問題，還是醫(yī)院管理中影響醫(yī)療質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)，已成為全球范圍突出的公共衛(wèi)生問題[6-7]。近二十年來，隨著醫(yī)療干預(yù)和支持水平不斷提高，免疫功能受損人群及其他危重患者不斷增多，在全球范圍內(nèi)，侵襲性真菌病的發(fā)病率明顯上升，已然成為人類健康的嚴(yán)重威脅，也正在成為醫(yī)院感染的常見致病菌[7-8]。

本研究關(guān)注基因測序方法在醫(yī)院空氣環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用，并分析真菌在各科室空氣環(huán)境中的分布特點(diǎn)，結(jié)果顯示，在醫(yī)院的不同地點(diǎn)，病原檢出情況存在差異，且霉菌在不同科室空氣環(huán)境中的相對含量最高，不同地點(diǎn)的隱球菌、念珠菌的差異相對明顯。在本研究所涉及的4個(gè)地點(diǎn)中，還同時(shí)檢出了相對含量較低的伊氏肺孢子菌。這些機(jī)會性致病真菌最容易導(dǎo)侵入呼吸道、皮膚、鼻腔等組織器官而造成相應(yīng)的真菌感染，對于危重癥患者、免疫抑制狀態(tài)患者，特別是開放氣道患者十分危險(xiǎn)。在本研究中，最常見的真菌病原包括曲霉、隱球菌、念珠菌、伊氏肺孢子菌等均有檢出，其中曲霉屬相對含量最高。而在收治危重癥患者多、氣道開放患者多的呼吸監(jiān)護(hù)室、外科監(jiān)護(hù)室中，空氣環(huán)境中檢出的曲霉、隱球菌的比例也較高，此結(jié)果提示，在醫(yī)院內(nèi)的不同地點(diǎn)，針對不同的宿主因素，需要采取不同感染防控策略，才有可能降低醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生率。

[1] Allegranzi B, Bagheri Nejad S, Combescure C, et al. Burden of endemic health-care-associated infection in developing countries: systematic review and meta-analysis[J]. Lancet, 2011, 377(9761): 228-241.

[2] Koch AM, Nilsen RM, Dalheim A, et al. Need for more targeted measures—Only less severe hospital-associated infections declined after introduction of an infection control program[J]. J Infect Public Health, 2015, 8(3): 282-290.

[3] Cao C, Jiang W, Wang B, et al. Inhalable microorganisms in Beijing’s PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event[J]. Environ Sci Technol, 2014, 48: 1499-1507.

[4] 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會感染學(xué)組, 中華結(jié)核和呼吸雜志編輯委員會. 肺真菌病診斷和治療專家共識[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2007, 30(11): 821-834.

[5] Chen K, Pachter L. Bioinformatics for whole-genome shotgun sequencing of microbial communities[J]. PLoS Comput Biol, 2005, 1(2): 106-112.

[6] Moore C. Point-of-care tests for infection control: should rapid testing be in the laboratory or at the front line?[J]. J Hosp Infect, 2013, 85(1): 1-7.

[7] Enoch DA, Ludlam HA, Brown NM, et al. Invasive fungal infections: a review of epidemiology and management options[J]. J Med Microbiol, 2006, 55: 809-818.

[8] Frohlich-Nowoisky J, Pickersgill DA, Despres VR, et al. High diversity of fungⅡn air particulate matter[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(31): 12814-12819.

（本文編輯：丁敏嬌）

Monitor of air borne hospital environment by Illumina high-throughput sequence

LI Yanming1,6, TONG Xunliang2, XU Hongtao3, TIAN Geng4, LANG Jidong4, XIAO Fei5, CAI Meng6. 1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Beijing Hospital, Beijing, 100730; 2.Department of Geriatrics, Beijing Hospital, Beijing, 100730; 3.Department of Laboratory Medicine, Beijing Hospital, Beijing, 100730; 4.Center of Biomedical Analysis, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing, 100084; 5.Key Laboratory of Geriatrics, Beijing Institute of Geriatrics, Beijing, 100730; 6.Department of Hospital Infection Control and Management, Beijing Hospital, Beijing, 100730

Objective: To monitor microorganisms in air borne environment in hospital and to analysis the distribution characters of microorganisms in different departments in hospital. Methods: Air samplers were utilized in four typical departments of hospital for airborne microorganisms’ collection. Microorganisms were identified by DNA sequencing analysis by Illumina MiSeq and HiSeq 2000 sequencing systems. Results: The airborne microorganisms from four departments were analyzed for microbiome sequencing and classified as fungi,species, bacteria species and viruses species. The ratio of pathogenic fungⅡn fungi was different in four departments and the ratio in two intensive care units were higher than its in outpatient department and emergency department. At the species level of fungi, ratio of yeast, mycotic fungus and dimorphic fungⅡn different department was shown. The relative ratio of aspergillus in mycotic fungus and the relative ratio of cryptococcus and candida in yeast was shown,respectively. Conclusion: Novel method was utilized in monitoring the air borne microorganisms in hospital environment and the relative ratio of common opportunistic pathogenwas satisfied. It is provided experiment based information in improving the methodology in monitoring hospital infection.

high-throughput sequence; hospital infection; aspergillus; cryptococcus; candida

R12

B

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.011

2015-03-07

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAI05B02）。

李燕明（1971-），女，北京人，副主任醫(yī)師。

蔡虻，主任護(hù)師，Email：caimeng@bjhmoh.cn。