項(xiàng)振飛，陸妙珍，張歡樂(lè)，張三典

（寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 放療科，浙江 寧波 315040）

·論 著·

PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表觀遺傳學(xué)改變及其機(jī)制

項(xiàng)振飛，陸妙珍，張歡樂(lè)，張三典

（寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院 放療科，浙江 寧波 315040）

目的：研究PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其作用機(jī)制。方法：應(yīng)用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、甲基化特異性PCR（MSP）法檢測(cè)PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系及組織中的表達(dá)和甲基化狀態(tài)。通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)、克隆形成、細(xì)胞周期等實(shí)驗(yàn)探討PLAGL1在結(jié)直腸癌中的作用。結(jié)果：PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和DLD1中呈完全甲基化，在SW620、SW480中呈半甲基化，在RKO中為非甲基化狀態(tài)；PLAGL1在104例結(jié)直腸癌組織中的甲基化率為64.4%；PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者的TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.001），同時(shí)PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.001），而與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡以及腫瘤分化程度未見顯著相關(guān)性；PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)可以明顯抑制HCT116細(xì)胞的增殖（P＜0.05），HCT116細(xì)胞的克隆形成數(shù)在PLAGL1恢復(fù)表達(dá)后明顯減少；恢復(fù)表達(dá)PLAGL1后HCT116細(xì)胞在G1期的比率明顯增加。結(jié)論：PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控，恢復(fù)表達(dá)PLAGL1后可以抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的增殖，并使HCT116細(xì)胞周期阻滯在G1期，PLAGL1在結(jié)直腸癌中起到抑癌基因的作用。

PLAGL1；結(jié)直腸腫瘤；DNA甲基化；表觀遺傳學(xué)

結(jié)直腸癌發(fā)病率高，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅人類健康。越來(lái)越多的研究顯示，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與抑癌基因的表觀遺傳學(xué)尤其是DNA甲基化修飾密切相關(guān)[1]。發(fā)生啟動(dòng)子區(qū)甲基化的新功能基因的發(fā)現(xiàn)有助于我們了解結(jié)直腸癌發(fā)生過(guò)程中腫瘤抑制通路的分子機(jī)制，同時(shí)有助于找到結(jié)直腸癌的潛在診斷及治療靶標(biāo)。PLAGL1基因位于人類染色體6q24.2，該位點(diǎn)在多種腫瘤中頻發(fā)重排。PLAGL1是母源性印記基因[2-4]。PLAGL1在多種腫瘤中表現(xiàn)出抑癌作用，可通過(guò)作用于p53抑制細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期發(fā)揮作用[5-7]。然而PLAGL1在腫瘤發(fā)生中充當(dāng)?shù)慕巧珓t取決于所處的細(xì)胞環(huán)境，PLAGL1在惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及橫紋肌肉瘤中則充當(dāng)癌基因角色[8-9]。PLAGL1的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控在多種腫瘤中[10-11]被報(bào)道。而PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制尚不明確，本研究旨在探討PLAGL1在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 人組織標(biāo)本及細(xì)胞系 104例結(jié)腸癌及癌旁組織來(lái)自2012年1月-2014年1月到寧波市李惠利醫(yī)院接受手術(shù)治療的結(jié)直腸癌患者，其中男57例，女47例，年齡35～68歲，平均（47±15）歲。癌旁標(biāo)本為離腫瘤5 cm遠(yuǎn)的結(jié)直腸組織，標(biāo)本獲取后立即放置到液氮中保存。樣本被分為I、Ⅱ、Ⅲ、IV期，其中I期和Ⅱ期共39例，Ⅲ期和IV期共65例。結(jié)直腸癌細(xì)胞系均購(gòu)自ATCC，分別為HCT116、SW480、SW620、RKO及DLD1，于37 ℃，5% CO2孵箱中復(fù)蘇、培養(yǎng)及傳代。

1.2 結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HCT116、SW480、SW620、RKO及DLD1）的處理 在處理前12 h以低濃度（30%融合度）重鋪于培養(yǎng)皿中，之后細(xì)胞用地西他濱（decitabine，DAC）（Sigma公司，MO，USA）處理，DAC終濃度為2μmol/L，每24 h換液，加藥滿96 h按下述方法收集細(xì)胞RNA。

1.3 提取RNA及RT-PCR 本研究細(xì)胞總RNA提取應(yīng)用Trizol（life technologies，MD，USA）法，1%瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計(jì)來(lái)鑒定細(xì)胞總RNA的質(zhì)量及濃度。提好的RNA保存于-80 ℃。用5μg總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并稀釋到100μL，取其中2.5 μL稀釋后cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)（25 μL體系）。PLAGL1基因PCR引物序列如下：上游引物5’-GGCATCTGCC ATTTGTCATTC-3’，下游引物5’-TTAGACGTGACAGCAATC CC-3（華大基因），產(chǎn)物長(zhǎng)度為265 bp，35個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參：上游引物：5’-GACCACAGTCCATGCCA TCAC-3’，下游引物5’-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（華大基因），25個(gè)循環(huán)。

1.4 DNA提取及硫化 迅速研磨冷凍標(biāo)本后于加有蛋白酶K的DNA提取液TES中消化過(guò)夜，用酚氯仿法抽提，100%乙醇沉淀，75%乙醇洗2遍，TE稀釋后分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?μg DNA溶于50 μL水中，于50 ℃金屬浴中亞硫酸氫鈉處理16 h，DNA樣本應(yīng)用Wizard DNA Clean-Up系統(tǒng)純化回收，NaOH脫磺酸處理，乙醇洗滌后溶于20 μL水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 甲基化特異性PCR（methylation-specific PCR，MSP）法 MSP引物：U（非甲基化引物）：上游引物5’-TTTTGTTTTTTTAGTTGTGAGATGG-3’，下游引物5’-ACTTACCTCCTATACCAACAACACC-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度155 bp，35個(gè)循環(huán)；M（甲基化引物）上游引物5’-GTTTTCGTTTTTTTAGTTGTGAGAC-3’，下游引物5’-AACTTACCTCCTATACCAACAACG-3’，產(chǎn)物長(zhǎng)度158 bp，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)MSP法分析都包括一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，即IVD（DNA treated in vitro with SssI methyltransferase）和一個(gè)陰性對(duì)照即正常人循環(huán)中淋巴細(xì)胞DNA。MSP法檢測(cè)結(jié)果在1.5%～2%瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像儀中得到分析。

1.6 MTT增殖實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染PLAGL1和轉(zhuǎn)染Vector滿48 h的HCT116細(xì)胞消化后以2 500個(gè)/孔均勻鋪在96孔板中，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、24、48和72 h）通過(guò)MTT分析方法測(cè)定細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)間段包括5個(gè)復(fù)孔，活細(xì)胞數(shù)通過(guò)酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處所測(cè)定的OD值來(lái)反映。

1.7 克隆形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染PLAGL1和轉(zhuǎn)染Vector滿48 h的HCT116細(xì)胞消化后以600個(gè)/孔鋪在6孔板中，同時(shí)用G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞，每3 d換一次液，到14 d后用75%冷乙醇固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)細(xì)胞所形成克隆數(shù)。

1.8 細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染PLAGL1和轉(zhuǎn)染Vector滿48 h的HCT116細(xì)胞消化后用70%預(yù)冷乙醇固定2 h以上，PI染色后于流式細(xì)胞儀中測(cè)定，分析細(xì)胞周期不同階段G1期、S期、G2期細(xì)胞所占比例。

1.9 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法 收集轉(zhuǎn)染PLAGL1和空載Vector 48 h后的HCT116細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后，立刻加入RIPA裂解液（含有10%蛋白酶抑制劑PMSF）并于冰上裂解15 min，4 ℃離心20 min收集上清，加入適量5×蛋白上樣緩沖液，沸水煮5 min，于SDS-PAG膠電泳后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，牛奶封閉2 h，一抗室溫孵育2 h或4 ℃過(guò)夜后，二抗孵育1～2 h，用增強(qiáng)發(fā)光液檢測(cè)目的蛋白。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間比較采用T-test統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)性分析采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá) RT-PCR技術(shù)檢測(cè)顯示PLAGL1在HCT116和DLD1中無(wú)表達(dá)，在SW620、SW480細(xì)胞中表達(dá)較低，在RKO細(xì)胞中表達(dá)較高。5-aza處理結(jié)直腸癌細(xì)胞系后，HCT116和DLD1中PLAGL1表達(dá)恢復(fù)，而SW620、SW480中PLAGL1表達(dá)增強(qiáng)，在RKO細(xì)胞中PLAGL1的表達(dá)無(wú)明顯改變。PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116和DLD1中呈完全甲基化，在SW620、SW480中呈半甲基化，在RKO中為非甲基化狀態(tài)（見圖1A）。

2.2 PLAGL1在結(jié)直腸癌組織中甲基化情況 應(yīng)用MSP法測(cè)定5例正常結(jié)直腸黏膜及104例結(jié)直腸癌組織中PLAGL1的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PLAGL1在5例正常組織中均為非甲基化狀態(tài)，排除組織特異性，而PLAGL1在104例結(jié)直腸癌組織中的甲基化率為64.4%（67/104）（見圖1B），PLAGL1在結(jié)直腸癌中頻發(fā)甲基化。

圖1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系及結(jié)直腸癌組織中PLAGL1與DNA甲基化的關(guān)系

2.3 PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者的TNM分期顯著相關(guān)（P＜0.001），同時(shí)PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P＜0.001），而與結(jié)直腸癌患者的性別、年齡，以及腫瘤分化程度未見顯著相關(guān)性（見表1）。

表1 PLAGL1甲基化與結(jié)直腸癌患者臨床特點(diǎn)相關(guān)性分析 n（%）

2.4 PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖及克隆形成能力的影響

PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)可以明顯地抑制HCT116細(xì)胞的增殖（P＜0.05）（見圖2A），HCT116細(xì)胞的克隆形成數(shù)在PLAGL1恢復(fù)表達(dá)后明顯減少（P＜0.05）（見圖2B），PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)可以抑制HCT116細(xì)胞的增殖及克隆形成能力。

2.5 PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示恢復(fù)表達(dá)PLAGL1后HCT116細(xì)胞在G1期細(xì)胞的比率明顯增加（見圖3A），Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示參與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1的表達(dá)明顯降低（見圖3B）?？梢砸种芻yclinD1的表達(dá)阻滯HCT116細(xì)胞周期于G1期。

圖2 恢復(fù)表達(dá)PLAGL1對(duì)HCT116細(xì)胞的增殖及克隆形成的影響

圖3 恢復(fù)表達(dá)PLAGL1對(duì)HCT116細(xì)胞周期的影響

3 討論

結(jié)直腸癌早期診斷率低，病死率高。近年來(lái)越來(lái)越多的研究顯示，DNA甲基化是腫瘤中抑癌基因表達(dá)缺失或降低的主要原因之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的作用。也有很多研究顯示表觀遺傳學(xué)的改變，尤其是抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[1-11]。有研究顯示PLAGL1與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，如PLAGL1基因甲基化在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮作用[12]，葉倫等[13]的研究表明PLAGL1蛋白的表達(dá)下調(diào)可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。并在多種腫瘤中其表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控[2-4，10-11]。但是PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表觀遺傳學(xué)改變及調(diào)控鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在表達(dá)缺失及表達(dá)降低，經(jīng)過(guò)5-aza（去甲基化藥物）處理后PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)得到了恢復(fù)，與結(jié)直腸癌細(xì)胞中PLAGL1的甲基化狀態(tài)檢測(cè)結(jié)果相一致，表明PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)受啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化調(diào)控，在結(jié)直腸癌中PLAGL1受DNA啟動(dòng)子區(qū)甲基化的調(diào)控從而導(dǎo)致PLAGL1基因表達(dá)的沉默，進(jìn)而提示我們?cè)诮Y(jié)直腸癌中PLAGL1基因充當(dāng)著抑癌基因的角色。在本組104例結(jié)直腸癌組織中，PLAGL1呈現(xiàn)頻繁甲基化，甲基化率高達(dá)64.4%（67/104），并且PLAGL1的甲基化狀態(tài)與結(jié)直腸癌的TNM分期顯著相關(guān)，提示PLAGL1的甲基化狀態(tài)檢測(cè)可作為早期結(jié)直腸癌診斷的潛在標(biāo)志物。PLAGL1在結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT116中恢復(fù)表達(dá)后可以抑制細(xì)胞的增殖和克隆形成，同時(shí)阻抑細(xì)胞周期于G1期，起到抑癌作用。PLAGL1可作為結(jié)直腸癌治療的潛在靶標(biāo)。

綜上所述，PLAGL1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)受DNA甲基化的調(diào)控，PLAGL1在結(jié)直腸癌中頻繁發(fā)生甲基化并與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，PLAGL1的恢復(fù)表達(dá)則可抑制HCT116細(xì)胞的增殖和克隆形成，并阻抑細(xì)胞周期，起到抑癌作用。

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（本文編輯：胡苗苗）

The epigenetic alteration and function of PLAGL1 in colorectal cancer

XIANG Zhenfei, LU Miaozhen,ZHANG Huanle, ZHANG Sandian. Department of Radiotherapy, Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital, Ningbo, 315040

Objective: Epigenetic alterations have played an important role in colorectal carcinogenesis. PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1, Also known asZAC; LOT1; ZAC1) is a gene associated with the development of many types of cancers. Our aims are to explore the expression and the function of PLAGL1 in colorectal cancer. Methods: RT-PCR (semi-quantitative reverse-transcription PCR) was used in this study to detect the expression level of PLAGL1 in colorectal cancer cell lines. The methylation of PLAGL1 promoter regain was detected with MSP (methylation specific PCR) in colorectal cancer cell lines and colorectal cancer tissues. MTT assay, colony formation and cell cycle analysis were used to explore the function of PLAGL1 in colorectal carcinogenesis. Results: The expression of PLAGL1 in colorectal cancer cell lines was regulated by promoter regain methylation. And PLAGL1 was frequently methylated in 64.4% (67/104) colorectal cancer tissue. Restoration of PLAGL1 expression in HCT116 inhibited cell proliferation and colony formation, and cell cycle of HCT116 was arrested at G1 phase. Conclusion: The expression of PLAGL1 in colorectal cancer is regulatied by DNA methylation.The restoration of PLAGL1 can suppressed the proliferation of colorectal cancer cell HCT116, and also arrest the cell cycle of HCT116 in G1 phase. PLAGL1 acts as a tumor suppressor in colorectal carcinogenesis.

PLAGL1; colorectal neoplasms; DNA methglation; epigenetics

R735.37

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.009

2014-10-29

項(xiàng)振飛（1981-），男，浙江寧波人，主治醫(yī)師，在職碩士生。