謝耀盛，金艷慧，謝海嘯，楊麗紅，朱麗青，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

·論 著·

凝血因子Ⅶ與Ⅹ聯(lián)合缺陷患者誤食鼠藥導(dǎo)致的表型變化及相關(guān)分析

謝耀盛，金艷慧，謝海嘯，楊麗紅，朱麗青，王明山

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 溫州 325015）

目的：探討1例遺傳性凝血因子VⅡ（FVⅡ）與因子X（FX）聯(lián)合缺陷癥患者誤食敵鼠鈉后實(shí)驗(yàn)室表型特點(diǎn)及其相關(guān)分析。方法：對1例誤食敵鼠鈉患者進(jìn)行止凝血指標(biāo)初篩試驗(yàn)和凝血因子促凝活性的多次檢測，并在多個(gè)療程（大于1年）治療后用DNA直接測序法對患者及家系成員進(jìn)行相關(guān)凝血因子基因分析及抗原等測定，同時(shí)選擇106例健康體檢者作對照。結(jié)果：患者敵鼠鈉中毒后治療前實(shí)驗(yàn)室檢查首次結(jié)果為凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）明顯延長，分別為102.4 s和88.5 s；凝血因子Ⅱ、VⅡ、IX、X促凝活性明顯減低，分別為7%、3%、8%和2%；在1年多治療期間多次復(fù)查PT、APTT仍明顯延長，F(xiàn)VⅡ、FX促凝活性為5%左右，而FⅡ、FIX促凝活性在治療1周后逐漸回升，12周后基本維持在正常水平?；颊逨7基因分析g.11267C＞T的純合突變導(dǎo)致Arg277Cys，F(xiàn)10基因g.28139G＞T的純合突變導(dǎo)致Val384Phe，其父親、母親、姐姐均存在F7基因g.11267C＞T和F10基因g.28139G＞T雜合子?；颊逨VⅡ及FX抗原分別為7%、30%。結(jié)論：遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷癥患者的實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)極似獲得性維生素K缺乏癥，基因分析是區(qū)別兩者的有效方法。

因子VⅡ缺乏；因子X缺乏；突變；血液凝固障礙；中毒

遺傳性凝血因子VⅡ（FVⅡ）和因子X（FX）缺陷是罕見的常染色體隱性遺傳性出血性疾病，遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷的實(shí)驗(yàn)室檢查可表現(xiàn)為凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）明顯延長，F(xiàn)VⅡ促凝活性（FVⅡ∶C）與FX促凝活性（FX∶C）減低，并且遺傳性FVⅡ與FX缺乏癥的實(shí)驗(yàn)室表型與基因突變位點(diǎn)及數(shù)量，以及對功能的影響程度等緊密相關(guān)[1-3]。敵鼠鈉鹽是常用的一種高效抗凝血?dú)⑹髣?，可抑制肝臟合成維生素K依賴的凝血因子Ⅱ、VⅡ、IX、X，影響凝血活酶及凝血酶原酶的合成，表現(xiàn)為PT、APTT延長和FⅡ促凝活性（FⅡ∶C）、FVⅡ∶C、FIX促凝活性（FIX∶C）、FX∶C減低[4]。本研究對1例遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷癥患者誤食敵鼠鈉鹽后進(jìn)行止凝血指標(biāo)初篩試驗(yàn)和凝血因子促凝活性的多次檢測及相關(guān)凝血因子的基因分析，探討其治療過程中的實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)及與獲得性維生素K缺乏癥的鑒別診斷。

1 資料和方法

1.1 一般資料 遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷癥患者為男性，年齡16歲，因誤食拌有老鼠藥（敵鼠鈉）的食物后來院就診，就診時(shí)僅有輕微的惡心、嘔吐、腹部不適等消化道癥狀，凝血常規(guī)檢查發(fā)現(xiàn)PT 102.4 s，APTT 88.5 s，F(xiàn)Ⅱ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C明顯減低，分別為7%、3%、8%和2%，其他常規(guī)凝血指標(biāo)和因子活性檢測均無異常，肝腎功能正常，平素?zé)o明顯出血癥狀，擬診斷為“老鼠藥中毒”予以維生素K等治療。用維生素K或凝血酶原復(fù)合物治療期間多次復(fù)查PT、APTT仍明顯延長，F(xiàn)VⅡ∶C和FX∶C維持在5%左右，F(xiàn)Ⅱ∶C和FIX∶C恢復(fù)到正常范圍內(nèi)?；颊吒改阜裾J(rèn)近親婚配。

選擇106例我院健康體檢者作為健康對照組，男62例，女44例，平均年齡32（16～60）歲。對照組經(jīng)查均無肝腎功能疾病，無血栓或出血史，經(jīng)過凝血因子活性檢測，所有受試者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集：征得患者及其家屬同意后，采集研究者及其家屬成員的外周靜脈血液標(biāo)本，用0.109 mol/L枸櫞酸鈉抗凝標(biāo)本。標(biāo)本采集后，一份用于凝血表型指標(biāo)檢測；另一份則用于標(biāo)本DNA的提取，在-80 ℃冰箱中保存待檢。

1.2.2 血漿凝血表型項(xiàng)目檢測：檢測研究標(biāo)本的PT、APTT、纖維蛋白原（FIB）、FⅡ∶C、FV促凝活性（FV∶C）、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C等各項(xiàng)指標(biāo)，儀器使用STAGO STA-R全自動(dòng)血液凝固分析儀，試劑盒由法國STAGO公司配套提供，所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。FVⅡ抗原（FVⅡ∶Ag）和FX抗原（FX∶Ag）采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測（由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血栓與止血實(shí)驗(yàn)室提供檢測）。

1.2.3 DNA模板的提?。河脴渲突蚪MDNA提取試劑盒抽提全血標(biāo)本中的單個(gè)核細(xì)胞的基因組DNA，抽提試劑盒購自上海賽百盛生物工程有限公司。

1.2.4 PCR擴(kuò)增：PCR試劑2×Taq PCR MasterMix（含染料）購自天根生化科技有限公司。PCR反應(yīng)體積為50 μL，包括DNA模板、Taq PCR MasterMix、上下游引物及蒸餾水。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定。研究中的FVⅡ和FX引物由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王學(xué)鋒教授饋贈(zèng)（引物具體序列及擴(kuò)增條件見參考文獻(xiàn)[5-6]）。

1.2.5 DNA序列分析：PCR產(chǎn)物原液由上海桑尼生物工程有限公司測序，用Chromas軟件將測序結(jié)果與美國NCBI基因庫所公布的FVⅡ序列（J02933）和FX序列（AF503510）進(jìn)行比對，尋找相應(yīng)的基因突變位點(diǎn)，并且突變序列再經(jīng)反向測序證實(shí)。針對新突變位點(diǎn)，用PCR擴(kuò)增結(jié)合DNA直接測序法篩查106例健康對照組來排除多態(tài)性。

2 結(jié)果

2.1 患者實(shí)驗(yàn)室表型指標(biāo)的變化 遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷患者誤食敵鼠鈉后，治療前實(shí)驗(yàn)室檢查首次結(jié)果PT、APTT明顯延長，分別為102.4 s和88.5 s，F(xiàn)Ⅱ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C分別為7%、3%、8%和2%。在1年多治療期間多次復(fù)查PT、APTT仍明顯延長，F(xiàn)VⅡ、FX促凝活性為5%左右，而FⅡ、FIX促凝活性在治療1周后逐漸回升，12周后基本維持在正常水平?；颊咂渌笜?biāo)FIB、FV∶C均在正常值范圍內(nèi)，見表1。

2.2 患者治療穩(wěn)定后及家庭成員的主要實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果 患者經(jīng)1年多的維生素K及相關(guān)治療后FVⅡ∶Ag和FX∶Ag分別為7%和30%；父親、母親、姐姐的PT稍延長，F(xiàn)VⅡ∶C、FX∶C、FX∶Ag稍減低或正常，APTT、FIB、FVⅡ∶Ag、FⅡ∶C、FV∶C、FIX∶C均在正常值范圍內(nèi)。見表2。

2.3 患者及家庭成員F7和F10基因分析結(jié)果 患者F7基因分析g.11267C＞T的純合突變導(dǎo)致Arg277Cys，F(xiàn)10基因g.28139G＞T的純合突變導(dǎo)致Val384Phe，其父親、母親、姐姐均存在F7基因g.11267C＞T和F10基因g.28139G＞T雜合子，見表3及圖1。F7基因Arg277Cys突變及F10基因Val384Phe突變均經(jīng)反向測序證實(shí)，并通過篩查健康對照組，除外基因多態(tài)性的存在可能，并經(jīng)測序驗(yàn)證了患者F7基因及F10基因的其他外顯子及側(cè)翼序列均未發(fā)現(xiàn)其他的突變。

表1 患者實(shí)驗(yàn)室表型指標(biāo)的變化結(jié)果

表2 患者及家庭成員主要實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

表3 患者及家庭成員基因測序結(jié)果

圖1 患者及對照組F7基因和F10基因相應(yīng)位點(diǎn)的測序圖

3 討論

凝血因子VⅡ和X是維生素K依賴的絲氨酸蛋白酶，與其他絲氨酸蛋白酶具有相似的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，在凝血過程中發(fā)揮重要作用。FVⅡ（a）與TF一起參與外源性凝血途徑的啟動(dòng)和凝血過程。FX可以被內(nèi)源凝血途徑FIXa/FVⅢa/Ca2+/磷脂酰絲氨酸（PF3）復(fù)合物或外源凝血途徑FVⅡa/TF/Ca2+復(fù)合物激活，F(xiàn)Xa與FVa、Ca2+、PF3形成凝血酶原酶復(fù)合物，激活凝血酶原為凝血酶，促進(jìn)凝血酶的生成。遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺乏會(huì)嚴(yán)重影響正常凝血功能，實(shí)驗(yàn)室檢查可表現(xiàn)為PT、APTT明顯延長，F(xiàn)VⅡ∶C與FX∶C明顯減低。

敵鼠鈉鹽又名雙苯殺鼠酮鈉鹽，化學(xué)名為2-（二甲基乙?；?1，3-茚滿二酮鈉鹽（C23H16O3Na），是淡黃色固體粉末，誤服0.25 g就可產(chǎn)生中毒癥狀，該藥進(jìn)入人體后干擾肝臟對維生素K的利用，抑制肝臟合成維生素K依賴的FⅡ、FVⅡ、FIX、FX，影響凝血活酶及凝血酶原酶的合成，使凝血時(shí)間延長導(dǎo)致出血；破壞毛細(xì)血管壁，使血管通透性顯著增加[4]。敵鼠鈉鹽中毒后實(shí)驗(yàn)室檢查可表現(xiàn)為PT、APTT延長，F(xiàn)Ⅱ∶C、FVⅡ∶C、FIX∶C、FX∶C減低[7]。因此，遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺乏癥與獲得性維生素K缺乏癥[8]的實(shí)驗(yàn)室檢查非常相似。本研究患者誤食伴有敵鼠鈉的食物來院就診，根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)初步診斷為“老鼠藥中毒”，予以維生素K等治療。

本研究患者誤食敵鼠鈉后反復(fù)使用維生素K或凝血酶原復(fù)合物治療1年多，期間多次復(fù)查PT、APTT明顯延長，F(xiàn)VⅡ∶C和FX∶C仍維持在低水平?jīng)]有改善，而FⅡ∶C、FIX∶C在治療1周后逐漸回升，12周后基本維持在正常水平。為排除是否存在先天性因子的缺陷，征求家屬同意后分析患者家庭成員的F7基因和F10基因，發(fā)現(xiàn)患者存在F7基因Arg277Cys純合突變和F10基因Val384Phe純合突變，且遺傳自具有相應(yīng)雜合突變位點(diǎn)的父親和母親。因此，該患者經(jīng)治療后FVⅡ∶C和FX∶C仍明顯偏低是由于遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷所致。

遺傳性FVⅡ和FX缺陷癥是單基因疾病，主要由基因突變所致，其臨床表現(xiàn)存在異質(zhì)性[9-11]，表現(xiàn)為因子抗原含量在不同先證者之間可以從＜1%到基本正常，且其在攜帶有雜合子的不同家系成員間具有更大的異質(zhì)性；臨床出血嚴(yán)重程度在不同先證者間可以從無出血史到明顯出血史等。本研究患者平素?zé)o明顯出血史，治療后若無明顯臨床出血表現(xiàn)，視具體情況可停止相應(yīng)的治療，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和減少藥物不良反應(yīng)的影響。

綜上所述，遺傳性FVⅡ與FX聯(lián)合缺陷癥的實(shí)驗(yàn)室檢查特點(diǎn)與獲得性維生素K缺乏癥極其相似，容易導(dǎo)致誤診和漏診。凝血因子基因分析是診斷先天性凝血因子缺陷的有效方法。

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（本文編輯：吳健敏）

Phenotype change and correlative analysis for a combined inherited factor VII and factor X deficiency due to accidental ingestion of a diphacinone rodenticide

XIE Yaosheng, JIN Yanhui, XIE Haixiao, YANG Lihong,ZHU Liqing, WANG Mingshan. Laboratory Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective: To explore the characteristics of laboratory phenotype and correlative analysis for a patient with combined inherited FVII and FX deficiency after he had ate a diphacinone rodenticide accidentally. Methods: The coagulant parameter screening tests and coagulation factors activities were detected for many times in the patient due to accidental ingestion of a diphacinone rodenticide. After the patient was treated for more than one year, gene analysis of correlated coagulation factors was analyzed in the patient and other family members with DNA direct sequencing. Select 106 persons of health examination as control. Results: After the patient was admitted to hospital, routine coagulation screening tests revealed the prolonged prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (APTT) and low levels of vitamin K-dependent coagulation factors (FII, FVII, FIX, FX) activity, which was 102.4 s, 88.5 s, 7%, 3%, 8% and 2%, respectively. During more than one year of treatment, the value of PT and APTT still showed significantly prolonged, FVII and FX activity levels were about 5%. While FII and FIX activity levels were in the normal range after 12 weeks of treatment. Two homozygous mutations, g.11267C＞T of F7 gene resulting in the substitution Arg277Cys and g.28139G＞T of F10 gene leading to the substitution Val384Phe, were identified in the patient. The patient’s parents and sister were heterozygous for Arg277Cys and Val384Phe mutations. FVII and FX antigen levels in the patient were 7% and 30%, respectively. Conclusion: There are many similarities in the characteristics of laboratory examination between combined inherited FVII and FX deficiency and acquired vitamin K deficiency. The best way to identify them is gene analysis.

FVII deficiency; FX deficiency; mutation; coagulation disorder; intoxication

R394.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.006

2015-03-16

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20100284）。

謝耀盛（1978-），男，浙江溫州人，主管技師。

王明山，主任技師，碩士生導(dǎo)師，Email：wywms@126.com。