溫超瑋，葉薇，周懷彬，呂建新，李偉

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

·論 著·

人線粒體DNA缺失宮頸癌細胞及其轉(zhuǎn)線粒體細胞的建立與初步分析

溫超瑋，葉薇，周懷彬，呂建新，李偉

（溫州醫(yī)科大學 檢驗醫(yī)學院 生命科學學院 浙江省醫(yī)學遺傳學重點實驗室，浙江 溫州 325035）

目的：探討溴化乙錠（EB）誘導法建立人線粒體DNA（mtDNA）缺失宮頸癌Hela S3細胞，以及再轉(zhuǎn)入線粒體構(gòu)建融合細胞的可行性，并對轉(zhuǎn)線粒體細胞進行初步分析。方法：采用低劑量（100 ng/mL）EB誘導法建立mtDNA缺失的ρ0Hela S3細胞，通過普通PCR、熒光定量PCR（qPCR）進行mtDNA缺失鑒定。采用聚乙二醇（PEG）介導細胞融合法，以正常人血小板為mtDNA供體轉(zhuǎn)入ρ0Hela S3細胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)線粒體細胞（transmitochondrial cybrids），并通過PCR、qPCR和透射電鏡觀察進行初步分析和鑒定。結(jié)果：普通PCR和qPCR結(jié)果證實EB誘導法能夠成功建立ρ0Hela S3細胞，同時結(jié)合透射電鏡證明轉(zhuǎn)線粒體細胞能夠恢復線粒體正常結(jié)構(gòu)。結(jié)論：采用EB誘導法可成功建立ρ0Hela S3細胞，且通過細胞融合構(gòu)建的轉(zhuǎn)線粒體細胞能夠恢復mtDNA復制和正常線粒體結(jié)構(gòu)，為研究mtDNA突變與線粒體功能異常相關(guān)疾病的關(guān)系提供可靠的實驗基礎(chǔ)。

線粒體DNA缺失細胞；轉(zhuǎn)線粒體細胞；線粒體DNA拷貝數(shù)；線粒體嵴

近數(shù)十年來，影響全球人類健康的許多疾病被證實與線粒體功能紊亂相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能異常能夠累及機體的神經(jīng)傳遞、能量代謝、內(nèi)環(huán)境平衡等，進而促進如阿爾茨海默病、帕金森氏癥、Leber’s遺傳性視神經(jīng)病變、糖尿病、耳聾、冠心病、原發(fā)性高血壓等疾病的發(fā)生[1-4]。自King等[5]利用溴化乙錠（ethidium bromide，EB）誘導構(gòu)建線粒體DNA（mtDNA）缺失細胞（ρ0cell）后又成功以血小板為外源mtDNA供體與細胞進行融合，ρ0細胞和轉(zhuǎn)線粒體細胞（transmitochondrial cybrids）已成為目前線粒體相關(guān)疾病的細胞生物學研究的主要方法之一。許多研究證實，將線粒體功能異常相關(guān)疾病患者的血小板與不同來源的ρ0細胞融合構(gòu)建的轉(zhuǎn)線粒體細胞能表現(xiàn)出一定程度的線粒體功能障礙[6-9]。本實驗采用傳統(tǒng)EB誘導法構(gòu)建ρ0Hela S3細胞，并通過再轉(zhuǎn)入正常外源線粒體，初步探討轉(zhuǎn)線粒體細胞的線粒體功能是否能夠恢復，為后續(xù)研究mtDNA突變與線粒體疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系提供可行的技術(shù)平臺。

1 材料和方法

1.1 材料 主要材料：人宮頸癌Hela S3細胞株（由Carolyn Suzuki Laboratory惠贈），透析/普通胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）購于Biochrom公司，丙酮酸鈉（pyruvate）、高糖DMEM培養(yǎng)液（pyruvate free）購于Gibco BRL公司，EB、尿嘧啶核苷（uridine）購于Sigma公司，聚乙二醇（PEG-1500）購于Fluka試劑公司，DMSO、胰酶細胞消化液購于碧云天生物技術(shù)研究所，Universal Genomic DNA Extraction Kit、Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）購于Takara寶生物（大連）有限公司。

1.2 ρ0Hela S3細胞的構(gòu)建 參照文獻[5]報道，將Hela S3細胞在含100 ng/mL EB的DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷和100 μ g/mL丙酮酸鈉）中培養(yǎng)。3～5 d傳代一次，誘導培養(yǎng)至2個月后挑取單克隆ρ0Hela S3細胞接種至24孔板，換用不含EB的DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷和100 μ g/mL丙酮酸鈉）進行擴大培養(yǎng)。

1.3 ρ0Hela S3細胞的鑒定 收集處于對數(shù)生長期的ρ0Hela S3細胞，用DNA提取試劑盒提取細胞總DNA，根據(jù)文獻[10]報道分別擴增線粒體基因片段和核基因片段，并通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析。采用TaqMan相對熒光定量PCR（qPCR）的方法，以APP基因為內(nèi)參基因，擴增mtDNA D-loop基因來檢測細胞mtDNA拷貝數(shù)的變化，相關(guān)引物和探針序列見表1-2。

表1 普通PCR引物序列

表2 熒光定量PCR引物和探針序列

1.4 轉(zhuǎn)線粒體細胞的構(gòu)建 參照文獻[11]，將分離得到的健康正常人血小板，與ρ0Hela S3細胞在37 ℃、新鮮配制的42% PEG溶液中迅速、充分混勻后加入DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS、50 μ g/mL尿嘧啶核苷、100 μ g/mL丙酮酸鈉）培養(yǎng)。3 d后換用DMEM選擇培養(yǎng)液（含10%透析FBS，不含尿嘧啶核苷和丙酮酸鈉）繼續(xù)培養(yǎng)。30 d后挑取單克隆細胞進行擴大培養(yǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)線粒體細胞的鑒定 分別收集處于對數(shù)生長期的ρ0Hela S3細胞、轉(zhuǎn)線粒體細胞和Hela S3細胞，采用試劑盒法分別提取3組細胞基因組DNA，通過普通PCR、qPCR檢測細胞mtDNA擴增情況和mtDNA拷貝數(shù)的變化，相關(guān)引物和探針序列見表1-2。用常規(guī)方法[12-13]制備超薄切片，透射電鏡觀察細胞內(nèi)線粒體形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料采用獨立樣本t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 mtDNA基因電泳分析 1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，ρ0Hela S3細胞、轉(zhuǎn)線粒體細胞和Hela S3細胞均能在218 bp處出現(xiàn)相應核基因片段條帶（見圖1a），ρ0Hela S3細胞（見圖1b，泳道HS-）在940 bp處沒有相應條帶，而轉(zhuǎn)線粒體細胞和Hela S3細胞（見圖1b，泳道HS-T和HS）則可擴增出相應條帶。

2.2 mtDNA拷貝數(shù)測定 qPCR結(jié)果顯示，EB誘導Hela S3細胞發(fā)生mtDNA拷貝數(shù)進行性下降，若誘導6 d后撤除EB，mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生逐漸恢復現(xiàn)象（見圖2a）。而EB誘導培養(yǎng)2個月后挑取單克隆擴大培養(yǎng)的ρ0Hela S3細胞則保持較低水平的mtDNA拷貝數(shù)（見圖2b）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖

2.3 轉(zhuǎn)線粒體細胞形態(tài)學觀察 挑取單克隆轉(zhuǎn)線粒體細胞進行篩選實驗，第5天可在顯微鏡下觀察到未融合細胞逐漸死亡（見圖3a），第10天融合成功的細胞小克隆群開始形成（見圖3b），第20天左右出現(xiàn)較大的融合細胞克隆群（見圖3c）。

2.4 線粒體結(jié)構(gòu)的觀察 透射電鏡結(jié)果顯示，ρ0Hela S3細胞內(nèi)線粒體嵴結(jié)構(gòu)被破壞，內(nèi)部呈現(xiàn)同心圓結(jié)構(gòu)（見圖4a，箭頭所指部位）。而轉(zhuǎn)線粒體細胞中線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部排列較整齊（見圖4b），與Hela S3細胞線粒體結(jié)構(gòu)類似（見圖4c）。說明外源線粒體已成功轉(zhuǎn)入ρ0Hela S3細胞。

圖2 mtDNA拷貝數(shù)qPCR分析結(jié)果圖

圖3 轉(zhuǎn)線粒體細胞篩選實驗結(jié)果圖（×200）

圖4 細胞透射電鏡結(jié)果圖

3 討論

氧化磷酸化是機體內(nèi)由核DNA和mtDNA共同參與編碼調(diào)控的生化途徑，核DNA和mtDNA突變的積累都可能影響線粒體呼吸鏈復合體的功能。運用細胞融合技術(shù)將外源mtDNA導入ρ0細胞構(gòu)建的轉(zhuǎn)線粒體細胞能夠有效排除核基因的干擾[14-16]，在統(tǒng)一核背景下研究mtDNA突變對線粒體呼吸鏈的影響。研究[17-20]發(fā)現(xiàn)，通過這種方法可以更好地關(guān)注mtDNA突變在氧化磷酸化過程中對線粒體呼吸鏈復合體的表達以及活性的發(fā)揮有何影響，從而探討其與線粒體疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

構(gòu)建轉(zhuǎn)線粒體細胞的必需要素之一是ρ0細胞的制備，EB誘導是其中最經(jīng)典的方法。研究[13]表明，EB誘導細胞mtDNA缺失依賴于mtDNA復制持續(xù)性抑制的過程。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)以低劑量（100 ng/ mL）EB誘導培養(yǎng)Hela S3細胞能夠進行性降低細胞mtDNA拷貝數(shù)，且誘導6 d后撤除EB，mtDNA拷貝數(shù)會發(fā)生逐漸恢復的現(xiàn)象。而EB誘導培養(yǎng)2個月后挑取單克隆擴大培養(yǎng)的ρ0Hela S3細胞則能保持較低水平的mtDNA拷貝數(shù)。這證實了EB誘導細胞mtDNA缺失是一個長期積累的過程。PCR是鑒定mtDNA缺失的常規(guī)方法之一，本實驗通過普通PCR和qPCR檢測mtDNA擴增情況和mtDNA拷貝數(shù)，證實ρ0Hela S3細胞mtDNA的缺失。同時透射電鏡結(jié)果也表明，ρ0Hela S3細胞的線粒體表現(xiàn)為嵴結(jié)構(gòu)被破壞和典型的同心圓結(jié)構(gòu)。

細胞融合技術(shù)是轉(zhuǎn)線粒體細胞制備的常用方法，PEG介導血小板導入ρ0細胞是最簡單易行的。在實驗中，我們通過選擇培養(yǎng)篩選融合成功的轉(zhuǎn)線粒體細胞，采用普通PCR、qPCR和透射電鏡證實了轉(zhuǎn)線粒體細胞mtDNA拷貝數(shù)恢復，線粒體嵴結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部排列較整齊。以上結(jié)果都說明轉(zhuǎn)入正常線粒體后，轉(zhuǎn)線粒體細胞能夠恢復mtDNA的正常復制以及完整線粒體結(jié)構(gòu)。

本實驗證實，采用EB誘導法可成功構(gòu)建具有低mtDNA拷貝數(shù)和異常線粒體結(jié)構(gòu)的ρ0Hela S3細胞，而通過細胞融合轉(zhuǎn)入正常外源線粒體的轉(zhuǎn)線粒體細胞能夠恢復mtDNA復制和正常線粒體結(jié)構(gòu)，為后期研究mtDNA突變對線粒體功能以及相關(guān)疾病的影響奠定了堅實可靠的基礎(chǔ)。

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（本文編輯：吳健敏）

Establishment and preliminary analysis on mtDNA-depleted cells and transmitochondrial cybrids

WEN Chaowei, YE Wei, ZHOU Huaibin, LV Jianxin, LI Wei. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics, School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective: To generate mtDNA-depleted Hela S3 cells and the transmitochondrial cybrids and investigate mtDNA replication and mitochondrial structure. Methods: Hela S3 cells were incubated with 100 ng/ mL ethidium bromide (EtBr). Polymerase chain reaction (PCR) and quantitative real-time PCR (qPCR) were performed in ρ0Hela S3 cells. Platelet-mediated transmitochondrial cybrids were established on the basis of ρ0Hela S3 cells and identified by PCR, qPCR and transmission electron microscopy (TEM). Results: ρ0Hela S3 cells had a low level of mtDNA replication and distorted cristae of mitochondria, whereas transmotichondrial cybrids had a normal mtDNA replication and regular arranged cristae of mitochondria. Conlusion: The generation of transmitochondrial cybrids provides a viable method for the further research of the effect of mtDNA mutations on mitochondrial respiratory function associated with diseases.

mtDNA-depleted cells; transmitochondrial cybrids; mtDNA copy numbers; cristae of mitochondria

Q2-33

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.06.003

2015-03-07

國家自然科學基金資助項目（81271918）。

溫超瑋（1987-），女，浙江蒼南人，實驗員。

李偉，副教授，Email：liweiwzmc@163.com。