李金海，陳輝春，戴華衛(wèi)，張海峰，王烈

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 普外科，浙江 溫州 325200；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 普外科，福建福州 350025）

·論 著·

脂多糖對(duì)人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖及凋亡的影響

李金海1，陳輝春1，戴華衛(wèi)1，張海峰1，王烈2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 普外科，浙江 溫州 325200；2.南京軍區(qū)福州總醫(yī)院 普外科，福建福州 350025）

目的：觀察脂多糖（LPS）對(duì)體外培養(yǎng)的人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖及凋亡的影響。方法：以密度梯度離心法獲取人臍血EPCs，體外誘導(dǎo)分化并鑒定。實(shí)驗(yàn)分對(duì)照組及不同濃度（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L）LPS組。四氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期。結(jié)果：①10.0 mmol/L組促進(jìn)EPCs增殖，20.0 mmol/L組抑制EPCs增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余2組對(duì)EPCs增殖能力無(wú)顯著影響，與對(duì)照組比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②20.0 mmol/L組促進(jìn)EPCs凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其余各組對(duì)EPCs凋亡率無(wú)明顯影響，與對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。③10.0、20.0 mmol/L組影響細(xì)胞周期，10.0 mmol/L組G0/G1期細(xì)胞減少，S和G2/M期增加；20.0 mmol/L組發(fā)生S期阻滯，G2/M期細(xì)胞減少，與對(duì)照組比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：LPS對(duì)EPCs增殖能力及凋亡的影響與其濃度有關(guān)，當(dāng)濃度為20.0 mmol/L時(shí)抑制增殖并促進(jìn)凋亡。

脂多糖；內(nèi)皮，血管；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管修復(fù)及新生血管形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此在治療缺血性疾病方面有著廣闊的應(yīng)用前景[1]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，影響細(xì)胞自噬，對(duì)細(xì)胞的增殖能力及凋亡的把控是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[2-3]。本研究探討各種濃度的LPS對(duì)人臍血EPCs分化增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 臍帶血取自2012年7月-2013年7月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦產(chǎn)科健康產(chǎn)婦，均經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)許可。淋巴細(xì)胞分離液（美國(guó)R&D System公司）；EGM-2MV EPCs培養(yǎng)基（杭州百通生物公司）；LPS、四氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）（均為德國(guó)Roche公司），DiI-acLDL（美國(guó)Molecular Probe公司），F(xiàn)ITC-UEA-I（美國(guó)Fermentas Life Science公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（北京寶賽生物技術(shù)有限公司）；DNA含量檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs培養(yǎng)：取產(chǎn)婦臍帶血50 mL，用等倍的PBS稀釋后，按1∶1比例加入淋巴細(xì)胞分離液，離心后取出單個(gè)核細(xì)胞層，用PBS清洗，滴加EPCs培養(yǎng)基（EGM-2MV），以1×106個(gè)/cm2密度接種于包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37 ℃環(huán)境下培養(yǎng)3 d。用PBS液洗掉非貼壁細(xì)胞，收集貼壁細(xì)胞備用。

1.2.2 EPCs鑒定：將貼壁細(xì)胞與濃度為2.4 μg/ mL Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-acLDL）在37 ℃孵育1 h后用2%多聚甲醛固定；再將濃度為10 μ g/mL FITC標(biāo)記的荊豆凝集素-I滴加于上述標(biāo)本中37 ℃孵育1 h，向已染色的標(biāo)本上滴加1 μ g/mL Hoechst 33342，避光孵育2 h；PBS沖洗3次，蒸餾水沖洗1次，滴加緩沖甘油封片。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡鑒定Dil-acLDL和結(jié)合FITC-UEA-I雙染色陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：將培養(yǎng)3 d的貼壁細(xì)胞消化、重懸后分5組：對(duì)照組（僅加入EGM-2MV）及在培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入不同濃度LPS組（2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L組），培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞。各組用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行調(diào)整，使各組間細(xì)胞基數(shù)相等。

1.2.4 EPCs增殖能力檢測(cè)：以（1.5～2.0）×104細(xì)胞/孔的密度在在96孔培養(yǎng)板上將細(xì)胞接種。每組6孔，每孔100 μL，每組均設(shè)6復(fù)孔。培養(yǎng)終止前4 h加入MTT（5 mg/mL），10 μL每孔，37 ℃培養(yǎng)4 h后終止，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，振蕩20 min后，讓結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀測(cè)波長(zhǎng)為570 nm時(shí)的吸光度A值，重復(fù)3次。

1.2.5 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：嚴(yán)格按Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行操作，將培養(yǎng)3 d的貼壁細(xì)胞消化后收集，加PI染液10 μL，Annexin V-FITC染液5 μL，37 ℃孵育10 min，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，上機(jī)檢測(cè)。將貼壁細(xì)胞消化、離心后收集細(xì)胞（濃度為5×105個(gè)/cm2），70%冷乙醇4 ℃固定，加入結(jié)合緩沖液490 μL，混勻，4 ℃保存；加RNase A，37 ℃水浴30 min；再加入PI染色均勻，4 ℃避光30 min，放入流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果以±s表示，每組重復(fù)3次，各組樣本數(shù)據(jù)比較采用方差齊性檢驗(yàn)，2組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPCs鑒定 根據(jù)EPCs具有攝取acLDL和結(jié)合UEA-I的能力，收集培養(yǎng)3 d的貼壁細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡鑒定經(jīng)FITC-UEA-I和DiI-acLDL單克隆抗體標(biāo)記的EPCs，DiI-acLDL染色陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色，F(xiàn)ITC-UEA-I染色陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色，F(xiàn)ITC-UEA-I和DiI-acLDL雙染色陽(yáng)性細(xì)胞視為正在分化的EPCs，呈黃色（見(jiàn)圖1）。

圖1 雙熒光染色鑒定EPCs（×400）

2.2 EPCs增殖能力及凋亡的檢測(cè) LPS作用48 h對(duì)EPCs增殖能力的影響：與對(duì)照組比較，10.0 mmoL/L組細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 5.43，P＜0.05）；20.0 mmoL/L組細(xì)胞增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.01，P＜0.05）；2.5 mmol/L、5.0 mmoL/L組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=0.38、t=0.72，均P＞0.05）（見(jiàn)表1）。LPS作用48 h對(duì)EPCs凋亡的影響：2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L、10.0 mmoL/L組與對(duì)照組凋亡率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=1.98、t=2.77、t=3.22，均P＞0.05）；20.0 mmoL/L組與對(duì)照組比較凋亡率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.14，P＜0.05）；10.0 mmoL/L與20.0 mmoL/L組比較，細(xì)胞增殖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.14，P＜0.05），凋亡率差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.89，P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 LPS作用48 h對(duì)EPCs增殖及凋亡的影響（n=3，±s）

表1 LPS作用48 h對(duì)EPCs增殖及凋亡的影響（n=3，±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與10.0 mmoL/L組比：bP＜0.05

2.3 LPS對(duì)EPCs細(xì)胞周期的影響 LPS作用48 h，其濃度為2.5 mmoL/L、5.0 mmoL/L時(shí)，EPCs主要積聚于G0/G1期，G0/G1、S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=1.45、t=0.65、t=1.51、t=3.37、t=0.51、t=0.68，P＞0.05）；LPS濃度為10.0 mmoL/L，S期及G2/M期細(xì)胞數(shù)增加，G0/ G1期細(xì)胞數(shù)減少，各期細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=6.12、t=4.48、t=11.42、t=8.56、t=27.18、t=6.77，P＜0.05）；10 mmoL/L 與20 mmoL/L組G0/G1期細(xì)胞數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.78，P＞0.05），S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別t=6.98、t=9.12，P＜0.05）（見(jiàn)表2）。

表2 LPS對(duì)EPCs周期的影響（n=3，±s，%）

表2 LPS對(duì)EPCs周期的影響（n=3，±s，%）

與對(duì)照組比：aP＜0.05；與10.0 mmoL/L組比：bP＜0.05

3 討論

EPCs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在缺血疾病、創(chuàng)傷愈合及血管內(nèi)皮修復(fù)中發(fā)揮重要作用，探尋影響其增殖及凋亡的物質(zhì)有著重要的臨床意義[4]。在機(jī)體受到創(chuàng)傷后，受損的細(xì)胞會(huì)自發(fā)形成自噬泡，溶酶體與自噬泡結(jié)合形成自噬小體，后者被體內(nèi)一些酶類分解為小分子物質(zhì)后發(fā)揮修復(fù)、愈合創(chuàng)傷細(xì)胞的作用。所以，自噬是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的一種自我保護(hù)機(jī)制，對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)的維持有重要意義。已有研究證實(shí)，LPS可通過(guò)直接誘導(dǎo)及間接激活途徑參與細(xì)胞的自噬過(guò)程，這些途徑可能均與活性氧反應(yīng)有關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚[5]。

本研究顯示，藥物作用48 h后與對(duì)照組比較，濃度為2.5、5.0 mmoL/L的LPS對(duì)EPCs增殖及凋亡均無(wú)顯著影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），EPCs多停滯于G0/G1期；在G0/G1期、S期、G2/M期，EPCs在的細(xì)胞數(shù)量方面與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)比對(duì)照組，10.0 mmoL/L的LPS可顯著提高EPCs的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），對(duì)EPCs凋亡影響不顯著，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），EPCs數(shù)量在G0/G1期減少，而在S和G2/M期增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），所以，EPCs向S期及G2/M期分化過(guò)程中，10.0 mmoL/L 的LPS發(fā)揮顯著促進(jìn)作用，進(jìn)而促進(jìn)EPCs增殖能力。對(duì)比對(duì)照組，20.0 mmoL/L的LPS可抑制EPCs增殖能力，并促進(jìn)其凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)比對(duì)照組，細(xì)胞主要集聚于S期，且G2/M細(xì)胞數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），證實(shí)細(xì)胞被阻滯于S期可能，導(dǎo)致細(xì)胞進(jìn)一步分化受到抑制，抑制細(xì)胞增殖。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，對(duì)比對(duì)照組，相對(duì)偏低濃度（2.5、5.0 mmoL/L）的LPS對(duì)EPCs的增殖能力及凋亡無(wú)明顯影響；中等濃度（10.0 mmoL/L）的LPS可明顯促進(jìn)EPCs增殖能力，在凋亡方面對(duì)EPCs無(wú)明顯影響；較高濃度（20.0 mmoL/L）LPS可明顯抑制細(xì)胞增殖能力，并顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

自噬是細(xì)胞應(yīng)對(duì)不利生存條件下的一種防御反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，并參與免疫應(yīng)答；凋亡是細(xì)胞不能耐受外界有害刺激時(shí)出現(xiàn)的主動(dòng)性死亡[6-7]。自噬多發(fā)生于凋亡之前，他們都是維持穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，雖然細(xì)胞自噬性死亡在機(jī)制和形態(tài)學(xué)上均不同于凋亡，但二者在信號(hào)通路上存在某些交叉，二者的誘發(fā)因素也有很大程度的一致性，且均與細(xì)胞的自我調(diào)節(jié)功能有關(guān)[8-9]。結(jié)合本研究，隨著LPS濃度的不斷增加對(duì)EPCs增殖能力并沒(méi)有相應(yīng)得到促進(jìn)，考慮細(xì)胞為維持自身穩(wěn)態(tài)，對(duì)自噬功能進(jìn)行自我調(diào)節(jié)有關(guān)，其具體機(jī)制也是我們下一步研究的重點(diǎn)。EPCs的凋亡與LPS濃度呈現(xiàn)一定的依賴性，考慮較大劑量的藥物濃度導(dǎo)致細(xì)胞中毒，超越細(xì)胞自我調(diào)節(jié)的限度，致使細(xì)胞凋亡[10]。因此，自噬的調(diào)控只能局限于一定藥物濃度范圍，過(guò)量的藥物濃度致使自噬被過(guò)度抑制，將可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。由此相信，若能找到LPS對(duì)ECPs作用的最適合藥物濃度，就可能有效控制EPCs的增殖能力及凋亡。隨著研究的不斷深入，LPS對(duì)于EPCs生物學(xué)特性的影響也將成為日后缺血性疾病干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

[1]Bruyndonckx L, Hoymans VY, Frederix G, et al.Endothelial progenitor cells and endothelial microparticles are independent predictors of endothelial function[J].J Pediatr, 2014, 165(2): 300-305.

[2]Wang J, Feng X, Zeng Y, et al.Lipopolysaccharide (LPS)-induced autophagy is involved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelial cells[J].BMC Microbiol, 2013, 13: 255.

[3]Hagiwara S, Iwasaka H, Koga H, et al.Stimulation of autophagy in the liver by lipopolysaccharide-induced systemic infammation in a rat model of diabetes mellitus[J].Biomed Res, 2010, 31(5): 263-271.

[4]Yoo CH, Na HJ, Lee DS, et al.Endothelial progenitor cells from human dental pulp-derived iPS cells as a therapeutic target for ischemic vascular diseases[J].Biomaterials, 2013, 34(7): 8149-8160.

[5]Li S, Zhou Y, Fan J, et al.Heat shock protein 72 enhances autophagy as a protective mechanism in lipopolysaccharide-induced peritonitis in rats[J].Am J Pathol, 2011, 179(6): 2822-2834.

[6]Ma Y, Galluzzi L, Zitvogel L, et al.Autophagy and cellular immune responses[J].Immunity, 2013, 39(2): 211-227.

[7]黃曉燕, 陳碧新, 高瞻, 等.自發(fā)性高血壓大鼠視網(wǎng)膜微血管稀少與細(xì)胞凋亡[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 40(2): 111-114.

[8]劉斯靈, 郝亞榮.脂多糖誘導(dǎo)的自噬在心血管方面的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展, 2011, 32(6): 834-836.

[9]McMillan EM, Quadrilatero J.Autophagy is required and protects against apoptosis during myoblast differentiation[J].Biochem J, 2014, 462(2): 267-277.

[10] 朱人大, 李曉強(qiáng), 孟慶友, 等.3-甲基腺嘌呤對(duì)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響[J].中華普通外科雜志, 2011, 29(7): 562-565.

（本文編輯：胡苗苗）

Effects of lipopolysaccharide on proliferation and apoptosis in human umbilical vein endothelial progeni-tor cells

LI Jinhai1, CHEN Huichun1, DAI Huawei1, ZHANG Haifeng1, WANG Lie2.1.Department of General Surgery, the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325200; 2.Department of General Surgery,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command, Fuzhou, 350025

Objective:To investigate the effect of proliferation, apoptosis and cell cycle of lipopolysaccharide (LPS) on human umbilical vein endothelial progenitor cells.Methods:mononuclear cells were isolated from human umbilical cord blood.Mononuclearcells (MNCs) were isolated from human umbilical cord blood in vitro by Ficoll density gradient centrifugation.EPCs were characterized as adherent cells with double positive to DiI-acLDL uptake and lectin binding by direct fuorescent staining under a laser scanning confocal microscope.There were fve groups.The control group and four LPS concentration groups: 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mmol/L.MTT was used to detect cell apoptosis and cell cycle.Results: ①10.0 mmol/L LPS promotes proliferation of EPCs, while 20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation of endothelial progenitor cells (P＜0.05).②20.0 mmol/L LPS promotes apoptosis of EPCs, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).③LPS at the concentration of 10.0 mmol/L reduces cells at G0/G1phase and increases S and G2/M phase cells; 20.0 mmol/L LPS induces EPCs blockade at S phase, G2/M phase cells decreased, compared with the control, the difference was signifcant (P＜0.05).Conclusion:10.0 mmol/L LPS promotes the proliferation of EPCs.20.0 mmol/L LPS inhibits the proliferation and promotes apoptosis of EPCs.

lipopolysaccharide; endothelium, vascular; proliferation; apoptosis

R331.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2015.02.008

2014-06-03

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2009J01186）。

李金海（1983-），男，山東棗莊人，主治醫(yī)師，碩士。

王烈，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Email：lijindahai@ 126.com。