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(1.南華大學附屬第二醫(yī)院婦產科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院超聲科)

·基礎醫(yī)學·

負載紫杉醇雙配體納米藥物輸送系統(tǒng)的體外生物性能評價

周兵1，廖海紅2，陳艷2，張霞2*

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院婦產科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院超聲科)

目的體外評價帶有葉酸和穿膜肽雙配體的、負載紫杉醇納米藥物輸送系統(tǒng)的生物性能。方法分別用H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs孵育細胞，利用流式細胞儀定量評價細胞對帶有不同配體納米藥物輸送系統(tǒng)的攝取量。再用H-F-Tat-P NPs孵育細胞，利用激光共聚焦顯微鏡定性評價不同細胞對H-F-Tat-P NPs的攝取量。結果葉酸受體陽性表達的MDA-MB-231細胞攝取H-F-Tat-P NPs的量明顯多于H-F-P NPs及H-Tat-P NPs。葉酸受體陰性表達的A549細胞攝取H-F-Tat-P NPs與H-Tat-P NPs的量多于H-F-P NPs。結論葉酸的靶向作用與穿膜肽的穿膜作用能夠協(xié)同提高藥物在靶細胞的聚集，進一步增強藥物輸送系統(tǒng)的治療作用，為開發(fā)新型、高效藥物輸送系統(tǒng)提供基礎。

紫杉醇； 穿膜肽； 葉酸； 納米藥物輸送系統(tǒng)

細胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一大類由10～30 個氨基酸組成、可以攜帶多種分子主動穿越各種生物膜屏障包括血腦屏障，導入近乎所有細胞的短肽[1]。自穿膜肽發(fā)現(xiàn)以來人們利用穿膜肽的轉運功能已將蛋白質、抗體、核酸、脂質體、顯像劑、細胞毒性藥物等多類物質導入細胞，為許多疾病分子水平的診斷、治療提供了有效手段，但普通穿膜肽缺乏靶向性制約了其進一步在體應用[2-3]。目前已經發(fā)現(xiàn)葉酸受體(folate receptor,FR) 在包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等在內的大部分惡性腫瘤組織中高度表達，而在正常組織中幾乎不表達[4-5]。因此，葉酸可作為腫瘤特異分子應用于靶向藥物輸送系統(tǒng)的研究[6-8]。

結合前期已經成功制備了負載紫杉醇的雙配體納米藥物輸送系統(tǒng)(heparin-folate-tat-paclitaxel nanoparticles,H-F-Tat-P NPs)[9]，本研究體外評價該系統(tǒng)的生物性能，為進一步研究其體內生物活性，特別是開發(fā)具有高效治療作用的藥物輸送系統(tǒng)提供基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器肝素鈉(Mw=15000 Da，效價150 U/mg)，葉酸，丁二酸酐(上海國藥集團)，732(H+)陽離子交換樹脂(上海山浦化工有限公司)，4，4′‐二甲氨基吡啶(DMAP)，二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)，1‐乙基‐3(3‐二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)(上海共價化學公司)，紫杉醇(沈陽天峰生物化學有限公司)，Tat肽Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(MW 1560 Da)，F(xiàn)ITC-Tat肽(上海強耀生物科技有限公司)，SephadexG-25葡聚糖凝膠，透析袋(MWCO 3500)(Parmacia，瑞典)，所有試劑反應前均進行重蒸處理。人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人肺癌細胞A549，RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、新生牛血清、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清、L-15細胞培養(yǎng)基(廣州速研生物科技有限公司)，氯化鈉(NaCl)、十二水合磷酸二鈉(Na2HPO4·12H2O)、氯化鉀(KCl)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)(廣州銘旺生物科技有限公司)，Bruker AVANCEAV 400核磁共振儀(美國布魯克公司)，Zetasizer Nano-Zs動態(tài)光散射儀(DLS，英國Malvern公司)，UV-2410紫外光分光光度計(日本島津儀器有限公司)，TOPCON DS150掃描電子顯微鏡，TF-FD-1冷凍干燥機(上海田楓儀器有限公司)，高效液相(HPLC，Shimadzu)，反向C18硅膠柱(SepaxHP-C18，4.6250 mm，5 m，Sepax，USA)，紫外檢測器(SPD-20 A，Shimadzu)。細胞計數(shù)板、細胞培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、移液器槍頭、離心管、EP管、6孔板(廣州杰特偉公司)，1 000 μL微量加樣槍×1支、20～100 μL微量加樣槍×1支、1～20 μL微量加樣槍×1支(法國吉而森公司)，CP225D電子分析天平(Sartorius,Germany)，CO2孵箱(GALAXY S)，電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，F(xiàn)ACSort流式細胞分析儀(Becton Dickinson,USA)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus fluoview fv1000,Tokyo,Japan)，低速離心機(LD5-2A)(Sigma,America)，LRH-150-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠)。

1.2 P NPs的制備參照前期制備方法制備H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs[9]。

1.3細胞培養(yǎng)人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人肺癌細胞A549置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度恒溫的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別為L-15、RPMI 1640，均含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素。每天更換培養(yǎng)液1次。

1.4流式細胞儀定量分析于6孔板內每孔加入約2.8×105個MDA-MB-231細胞或A549細胞，加入適量培養(yǎng)液放入孵箱培養(yǎng)24 h后吸去細胞培養(yǎng)液，加入2～3 mL PBS 緩沖液重復漂洗2～3遍，以去掉細胞代謝產物和死細胞；再分別加入H-F-P NPs 、H-Tat-P NPs 及H-F-Tat-P NPs放入孵箱孵育4 h。制備成細胞懸液后利用流式細胞分析儀定量分析細胞攝取情況，上機檢測前將裝有待測樣品的流式管避光保存在冰里。

1.5激光共聚焦顯微鏡將2個蓋玻片分別置于6孔板內，加入約3×104個MDA-MB-231細胞或A549細胞于每個蓋玻片上，放入孵箱培養(yǎng)24 h后吸去蓋玻片上的培養(yǎng)液，加入2～3 mL PBS 緩沖液重復漂洗2～3遍，以去掉細胞代謝產物和死細胞；再加入H-F-Tat-P NPs放入孵箱孵育4 h。細胞固定及染色后將蓋玻片覆于載玻片上，激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞攝取情況。

2 結 果

2.1流式細胞分析儀定量分析細胞對載藥納米粒的攝取情況分別用H-F-P NPs、H-Tat-P NPs及H-F-Tat-P NPs作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞，孵育4 h后，利用流式細胞分析儀定量分析細胞對載藥納米粒的攝取情況，結果發(fā)現(xiàn)葉酸受體表達陽性的MDA-MB-231細胞攝取H-F-P NPs及H-F-Tat-P NPs的量明顯多于葉酸受體表達陰性的A549細胞，而MDA-MB-231細胞與A549細胞對H-Tat-P NPs的攝取量基本一致(圖1)，葉酸受體表達陰性的A549細胞攝取H-F-Tat-P NPs及H-Tat-P NPs的量多于H-F-P NPs(圖1b)，因此推測葉酸受體介導的胞吞作用及Tat介導的穿膜作用能夠促進細胞對納米粒的攝取，而Tat介導的穿膜作用可能與細胞種類無關。

2.2激光共聚焦顯微鏡定性分析細胞對載藥納米粒的攝取情況用H-F-Tat-P NPs分別作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞，孵育4 h后，利用激光共聚焦顯微鏡定性分析細胞對載藥納米粒的攝取情況，結果發(fā)現(xiàn)MDA-MB-231細胞內綠色熒光強度強于A549細胞(圖2)，推測葉酸受體介導的胞吞作用能夠促進細胞對納米粒的攝取。

圖1 用H-F-P NPs 、H-Tat-P NPs 及H-F-Tat-P NPs作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞4 h后的流式細胞圖

圖2 用H-F-Tat-P NPs分別作用于MDA-MB-231細胞和A549細胞，孵育4 h后的激光共聚焦圖(60×) 左邊為Hochest33342藍色熒光標記的細胞核；中間為Oregon green488綠色熒光標記的H-F-Tat-P NPs；右邊為兩者的合并

3 討 論

本研究選用葉酸受體表達陽性的乳腺癌細胞MDA-MB-231和葉酸受體表達陰性的肺癌細胞A549來評估負載紫杉醇的雙配體納米藥物輸送系統(tǒng)(FITC標記納米粒) 的生物性能。結果顯示葉酸紫杉醇納米粒組及雙配體紫杉醇納米粒組MDA-MB-231細胞內熒光強度明顯強于A549細胞，提示葉酸受體介導的胞吞作用可能促進細胞對納米粒的攝取。兩種細胞對Tat紫杉醇納米粒的攝取量基本一致，提示Tat的穿膜作用可能與細胞種類無關。雙配體紫杉醇納米粒組與葉酸紫杉醇納米粒組、Tat紫杉醇納米粒組對比，MDA-MB-231細胞內綠色熒光強度明顯增強，說明葉酸與Tat可能起協(xié)同作用。A549細胞在Tat紫杉醇納米粒組及雙配體紫杉醇納米粒組細胞內熒光強度并無明顯區(qū)別，且均強于葉酸紫杉醇納米粒組，提示Tat可能促進細胞對納米粒的攝取。

本研究用Oregon green綠色熒光標記納米粒，Hochest33342藍色熒光標記細胞核，進一步運用激光共聚焦纖維鏡來觀察腫瘤細胞對納米粒的攝取情況。用雙配體紫杉醇納米粒作用于葉酸受體陽性表達的MDA-MB-231細胞和葉酸受體陰性表達的A549細胞，結果顯示MDA-MB-231細胞內綠色熒光強度強于A549細胞，推測葉酸可能促進納米粒進入腫瘤細胞內。

葉酸和穿膜肽共同修飾的納米藥物輸送體系，能夠協(xié)同促進腫瘤細胞對載藥納米粒的攝取，提高腫瘤細胞內藥物濃度，從而有效抑制腫瘤細胞生長，其抑瘤效果優(yōu)于單配體修飾的納米藥物輸送系統(tǒng)，這為進一步體內實驗打下基礎。

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InvitroBiologicalActivitiesofPaclitaxelNanoparticleswithDualLigands

ZHOU Bing,LIAO Haihong，CHEN Yan，et al

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecondAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo evaluate in vitro biological activities of paclitaxel nanoparticles with dual ligands.MethodsThe cells were incubated with H-F-P NPs,H-Tat-P NPs,or H-F-Tat-P NPs,and then evaluated by using flow cytometry.Then the cells were incubated with H-F-Tat-P NPs,and evaluated by using confocal laser scanning microscopy.ResultsQuantitative analysis of cellular uptake of NPs by flow cytometry showed the extend of celluar uptake for A549 cell lines was:H-F-Tat-P NPs > H-Tat-P NPs > H-F-P NPs.For MDA-MB-231 cells:H-F-Tat-P NPs >H-F-P NPs> H-Tat-P NPs.Qualitative analysis of cellular uptake of H-F-Tat-P NPs by confocal laser scanning microscopy showed the fluorescent signal of NPs in MDA-MB-231 cells was higher than that of A549 cells under the same conditions.ConclusionThe strategy on nanomedicine with dual ligands can enhance the cellular uptake of drug thereby improve its chemotherapeutic efficiency.The nanoparticle system could be used as a promising cancer cell specific delivery system for further investigation.

folate； tat； paclitaxel； nanoparticle system

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.009

2015-05-19；

2015-06-14

*通訊作者，E-mail：290087808@qq.com.

R737.3

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(此文編輯：朱雯霞)