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(1.南華大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院)

·基礎(chǔ)醫(yī)學·

辛伐他汀改善神經(jīng)源性肺水腫大鼠血清孵育后肺微血管內(nèi)皮細胞的生長

符暉1*，王橋生1，劉雁2，周斌2，彭忠田1，梁咸章1

(1.南華大學附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001;2.南華大學醫(yī)學院)

目的觀察辛伐他汀對神經(jīng)源性肺水腫(NPE)大鼠血清孵育后肺微血管內(nèi)皮細胞(PMECs)生長的影響及Bax和Bcl-2表達的影響。方法制備NPE大鼠模型的血清，將體外培養(yǎng)的大鼠PMECs隨機分成正常對照組、NPE24 h組、NPE48 h組、辛伐他汀24 h組、辛伐他汀48 h組；NPE組予NPE大鼠模型的血清分別孵育24 h和48 h，辛伐他汀組在NPE大鼠血清孵育的基礎(chǔ)上予1 μmol/L辛伐他汀干預(yù)24 h和48 h。通過細胞計數(shù)法描記生長曲線觀察各組細胞生長情況，Western-bolt和RT-PCR分別檢測各組PMECs內(nèi)Bax和Bcl-2蛋白與mRNA表達情況。結(jié)果NPE24 h組及48 h組PMECs生長明顯減慢，倍增時間延長，有大量漂浮的細胞碎片；辛伐他汀24 h組和48 h組PMECs數(shù)量顯著增高。同正常對照組相比，NPE24 h組和48 h組PMECs內(nèi)Bax蛋白和mRNA表達顯著增高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白和mRNA表達降低(P<0.05)。與相應(yīng)NPE組相比，辛伐他汀24 h組及48 h組Bax蛋白和mRNA表達顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白和mRNA表達增高(P<0.05)。同辛伐他汀24 h組相比，辛伐他汀48 h組PMECs內(nèi)Bcl-2蛋白和mRNA表達顯著增高(P<0.05)。結(jié)論辛伐他汀可改善NPE大鼠血清孵育后PMECs的生長，其機制可能與上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達有關(guān)。

辛伐他?。?神經(jīng)源性肺水腫； 肺微血管內(nèi)皮細胞； Bax； Bcl-2

神經(jīng)源性肺水腫(neurogenic pulmonary edema，NPE)是指在無原發(fā)性心、肺和腎等疾病的情況下，由顱腦損傷或中樞神經(jīng)系統(tǒng)其他疾病引起的突發(fā)性顱內(nèi)壓增高而導致的急性肺水腫，又稱中樞性肺水腫。其病程進展快，治療困難，病死率高。到目前為止，NPE的發(fā)病機制仍然不清楚。有研究報道，繼發(fā)炎癥反應(yīng)導致的肺血管內(nèi)皮損傷、肺血管通透性增加可能是其機制之一[1-3]。最近有學者研究發(fā)現(xiàn)，肺部血管內(nèi)皮細胞凋亡參與了NPE的形成[4-5]?？梢姡装Y反應(yīng)等因素導致肺血管內(nèi)皮細胞損傷、凋亡可能在NPE發(fā)生中起重要作用。而近年大量研究表明辛伐他汀除了其調(diào)脂作用外，還有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗凋亡，具有保護內(nèi)皮細胞功能的作用[6-8]。本文作者前期研究亦發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可抑制膿毒癥誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞凋亡，其機制可能與上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax有關(guān)[9]。而目前辛伐他汀對NPE肺血管內(nèi)皮細胞的影響及機制還不清楚。本研究通過辛伐他汀干預(yù)NPE大鼠血清孵育的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMECs)，檢測PMECs生長情況及不同時間點Bcl-2、Bax蛋白和mRNA的表達變化，探討辛伐他汀對NPE大鼠PMECs的保護機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料清潔級雄性SD大鼠，250～300 g，50只，購買于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。PMECs(武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司，產(chǎn)品編號：MIC-CELL-0001)；辛伐他汀(大連美侖生物科技有限公司，規(guī)格5 g/瓶)；TRIZOL試劑(Life Technologies Corporation,USA)，SYBR Green qRCR Mix(TOYOBO CO.,LTD)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Fisher Biochemical Product (Beijing) Co.,Ltd)，Bax多克隆抗體(ImmunoWay Biotechnology Company，USA)；Bcl-2多克隆抗體(ABZOOM BIOLABS,Inc,USA)；羊抗兔Bax二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.USA)；羊抗兔Bcl-2二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.USA)；羊抗鼠β-actin二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.USA)。

1.2大鼠NPE血清制備參考小腦延髓池穿刺法制作大鼠NPE模型[10]，實驗大鼠術(shù)前12 h禁食但不禁水，10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射進行麻醉固定，麻醉后氣管切開行氣管插管，用1 mL注射器從枕骨粗隆下0.6～0.7 cm進針，進針深度1.0～1.5 cm，穿刺進入小腦延髓池；穿刺針進入小腦延髓池后即刻在大鼠腦池內(nèi)注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL。如大鼠出現(xiàn)呼吸困難，氣管插管內(nèi)可見水腫液或粉紅色泡沫痰視為模型復制成功[11]。模型復制成功1 h后處死動物，收集血清備用。

1.3實驗分組及干預(yù)將體外培養(yǎng)的PMECs隨機分成正常對照組、NPE組和辛伐他汀組；其中NPE組根據(jù)NPE大鼠血清孵育時間分成NPE24 h組和NPE48 h組兩個亞組，辛伐他汀組按干預(yù)時間分成辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組兩個亞組。其中對照組采用普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，NPE24 h組和NPE48 h組采用含20%NPE大鼠血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別孵育24 h和48 h。辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組在NPE組的基礎(chǔ)上加入1 μmol/L辛伐他汀培養(yǎng)，分別孵育24 h和48 h。各組到相應(yīng)時間點細胞計數(shù)，檢測Bax、Bcl-2蛋白和mRNA表達情況。

1.4細胞計數(shù)取PMECs接種于24孔板中，1×104/孔，同時加入含20%NPE大鼠血清或含1 μmol/L辛伐他汀的NPE大鼠血清進行孵育，對照組予普通DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別于第24 h、48 h和72 h各組孔隨機取3個，消化，吹打成單細胞懸液后，0.04%臺盼藍染色2 min，計算存活細胞數(shù)量，計數(shù)3次，實驗重復2次，計算其平均數(shù)。以時間為橫坐標(h)，細胞數(shù)量(1×105個)為縱坐標繪制各組的細胞生長曲線。

1.5 Western-bolt檢測Bax和Bcl-2蛋白表達

加入細胞裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，取上清液，Bradford法測定蛋白濃度。計算含20 μg總蛋白的溶液體積作為上樣量，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。Bax和Bcl-2一抗室溫孵育2 h后4 ℃過夜，HRP標記的二抗室溫孵育1 h后，加顯色液發(fā)光，顯影定影。將膠片掃描后用圖像分析軟件IPP6.0對圖像進行各條帶的灰度值測定，以目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值作為半定量依據(jù)，每組重復3次。

1.6實時熒光定量PCR檢測Bax和Bcl-2 mRNA表達TRIZOL法提取總的RNA并定量，具體按照試劑盒說明進行。取總RNA 20 μg進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。加入cDNA 1 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL 2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL及ddH2O 7 μL，總體積 20 μL進行擴增Bax 、Bcl-2和β-actin。兩步法Real-Time定量，預(yù)變性95 ℃，3 min，之后每一步變性95 ℃，10 s，58 ℃退火延伸30 s，共進行35個循環(huán)，每次在延伸階段讀取熒光值。相關(guān)引物序列及擴增片段長度如下：Bcl-2上游引物：5′TGTGGCCTTCTTGAGTTCG3′，下游引物：5′CATCCCAGCCCTCCGTTATCC3′，擴增片段長度為242 bp；Bax上游引物：5′TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG3′，下游引物：5′GTCCAGGCCCATGATGGTTCT3′，擴增片段長度為542 bp；β-actin上游引物：5′CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC3′，下游引物：5′TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT3′，擴增片段長度為852 bp。2-△△CT法計算Bax mRNA和Bcl-2mRNA的相對表達量。

1.7統(tǒng)計學方法所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0進行處理。正態(tài)分布計數(shù)資料用均數(shù)±標準差表示，各組Bax蛋白和mRNA及Bcl-2蛋白和mRNA采用One Way ANOVA進行比較，組間多重比較采用LSK法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1細胞生長曲線NPE血清干預(yù)組孔內(nèi)PMECs生長明顯減慢，倍增時間較正常對照組延長，細胞數(shù)量增加很少，有大量漂浮的細胞碎片。當細胞數(shù)大于1.0×105個后，細胞增長迅速。同NPE組相比，辛伐他汀干預(yù)后，在孵育24 h、48 h和72 h，PMECs數(shù)量均顯著增高(P<0.05)。見圖1。

2.2各組PMECs的Bax mRNA和蛋白表達同正常對照組相比，NPE24 h組和NPE48 h組PMECs的Bax mRNA表達均增高(P<0.05)；同NPE24 h組和NPE48 h組相比，辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組Bax mRNA表達均減低(P<0.05)，但兩組之間Bax mRNA表達無差異(P>0.05)。蛋白電泳圖及統(tǒng)計分析顯示：與正常對照組相比，NPE 24 h組和NPE48 h組PMECs的Bax蛋白表達增高(P<0.05)，NPE48 h組Bax蛋白表達較NPE24 h組增高(P<0.05)；而辛伐他汀干預(yù)后，辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組Bax蛋白表達表達降低(P<0.05)；辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組Bax蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

圖1 各組細胞生長曲線 與NPE組比較，a：P<0.05

圖2 各組PMECs的Bax mRNA和蛋白表達情況 與正常對照組相比，a：P<0.05，b：P<0.05；與NPE24 h組和NPE48h組相比，c：P<0.05,d：P<0.05

2.3各組PMECs的Bcl-2mRNA和蛋白表達與正常對照組相比，NPE24 h組和NPE48 h組PMECs的Bcl-2 mRNA表達均減低(P<0.05)，NPE48 h組Bcl-2 mRNA表達較NPE24 h組降低(P<0.05)；與NPE24 h組和NPE48 h組相比，辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組Bcl-2 mRNA表達均增高(P<0.05)，兩組Bcl-2 mRNA表達之間差異有顯著性(P<0.05)。蛋白電泳圖顯示：與正常對照組相比，NPE24 h組和NPE48 h組PMECs的Bcl-2蛋白表達減少(P<0.05)；而辛伐他汀干預(yù)后，辛伐他汀24 h組和辛伐他汀48 h組Bcl-2蛋白表達較NPE24 h組和NPE48 h組均增高(P<0.05)；同辛伐他汀24 h組相比，辛伐他汀48 h組Bcl-2蛋白表達增高(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組PMECs的Bcl-2 mRNA和蛋白表達情況 與正常對照組比較，a：P<0.05,b：P<0.05；與NPE24 h組比較，b：P<0.05；與NPE24 h組和NPE48h組比較，c：P<0.05,d：P<0.05

3 討 論

就NPE發(fā)生的病理生理機制，一是血流動力學機制，1975年，Theodore等[12]就神經(jīng)源性肺水腫提出了著名的沖擊傷理論，這一理論認為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后機體的應(yīng)激反應(yīng)導致血中兒茶酚胺含量顯著增高，進而血流動力學急劇變化，體循環(huán)內(nèi)大量血液進入肺循環(huán)內(nèi)。一方面肺毛細血管床有效濾過壓急劇增高，從而形成肺水腫；另一方面血流沖擊造成血管內(nèi)皮細胞損傷，大量血漿蛋白外滲導致急性肺水腫進一步加重。另一個是炎癥反應(yīng)學機制，神經(jīng)中樞局部和繼發(fā)的全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，導致大量的細胞因子、趨化因子、神經(jīng)肽物質(zhì)P等釋放，導致肺血管內(nèi)皮通透性增加，誘發(fā)肺水腫[1]。

本研究結(jié)果顯示，NPE大鼠血清孵育PMECs后，細胞生長減慢，并可見大量的細胞碎片，而予辛伐他汀干預(yù)NPE大鼠血清孵育的PMECs后，細胞生長明顯改善。Skrabal等[3]用Foley氣囊導管充氣誘發(fā)豬腦死亡的實驗研究發(fā)現(xiàn)，其血清TNF-a、IL-1β、 IL-6等細胞因子水平顯著增高，并且心、肺和腎組織IL-1β、 IL-6、MCP-1 和TGF- β表達均有顯著增高。提示嚴重中樞損傷可誘發(fā)機體全身系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，導致外周器官組織損傷。本研究結(jié)果顯示予辛伐他汀干預(yù)后，NPE大鼠血清孵育的PMECs生長改善。這可能與辛伐他汀明確的抗炎作用及拮抗血管內(nèi)皮細胞凋亡等因素有關(guān)[13-15]。

本文辛伐他汀干預(yù)大鼠NPE血清孵育的PMECs 后24 h和48 h，PMECs內(nèi)Bax蛋白和mRNA表達顯著降低，而Bcl-2蛋白和mRNA則表達增高；其中Bcl-2蛋白和mRNA在辛伐他汀干預(yù)48 h后較24 h表達均增高，但對Bax蛋白和mRNA的表達抑制作用與時間無關(guān)。提示辛伐他汀改善PMECs的生長機制可能與上調(diào)的Bcl-2和下調(diào)Bax表達有關(guān)。Bc1-2 家族在細胞內(nèi)凋亡信號傳導中起重要作用。Bcl-2 和Bax 是Bcl-2家族中與細胞凋亡關(guān)系密切的兩種基因，前者為抗凋亡基因，后者為促凋亡基因，兩者間的平衡影響凋亡的發(fā)生。由此，辛伐他汀可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax變化，從而拮抗大鼠NPE誘導的細胞凋亡，改善細胞生長及活性，發(fā)揮細胞保護作用。先期研究亦發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達抑制膿毒癥誘導的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞凋亡，改善細胞生長，發(fā)揮血管內(nèi)皮細胞保護作用[9]。

車忠應(yīng)等[16]研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀預(yù)處理心肌缺血再灌注大鼠后，可上調(diào)心肌組織中Bcl-2、下調(diào)Bax表達，抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積，對大鼠心肌缺血再灌注有保護作用。另有研究發(fā)現(xiàn)辛伐他汀可上調(diào)Bcl-2的表達和抑制caspase-3表達，減少神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用[17]?？梢姡练ニ】赏ㄟ^調(diào)節(jié)Bcl-2 和Bax表達變化，抑制多種病因所致的細胞凋亡，起到保護細胞作用。

本研究僅觀察了辛伐他汀對NPE大鼠血清生長情況的影響及其對凋亡蛋白Bcl-2和 Bax表達的影響。其改善大鼠血清孵育后PMECs的生長的機制比較復雜，是否與通過抑制細胞凋亡或影響其增殖分化，還是其他機制，有待進一步研究探索。

辛伐他汀可改善NPE大鼠血清孵育后PMECs的生長，其機制之一可能與上調(diào)Bcl-2表達和下調(diào)Bax表達有關(guān)，隨著時間延長對Bcl-2表達影響更加明顯。

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SimvastatinImprovestheGrowthofPulmonaryMicrovascularEndothelialCellsIncubatedinSerumofNeurogenicPulmonaryEdemaRat

FU Hui,WANG Qiaosheng,LIU Yan,et al

(DepartmentofCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo observe the effect of simvastatin on the growth of pulmonary microvascular endothelial cells (PMECs) incubated in the serum of neurogenic pulmonary edema (NPE) rat and expression of Bax and Bcl-2 of PMECs.MethodsThe PMECs were randomly divided into five groups,the control group,NPE 24 h group,NPE 48 h group,simvastatin 24 h group and simvastatin 48 h group.The two NPE groups were incubated in rat serum for 24 h and 48 h respectively.The two simvastatin groups were treated with 1 μmol/L simvastatin,also incubated in rat serum for 24 h and 48 h respectively.The cell growth in each group was determined by the cell growth curve of cytometry,while the expression of Bax and Bcl-2 was detected by Western-bolt and RT-PCR.ResultsIn the NPE 24 h and NPE 48 h groups,the growth rate of PMECs was significantly decreased with increased doubling time and a large amount of floating cell debris.In the simvastatin 24 h and simvastatin 48 h groups,the number of PMECs increased significantly.The expressions of Bax was significantly upregulated (P<0.05),while the expressions of Bcl-2 was significantly downregulated (P<0.05) in the NPE 24 h and NPE 48 h groups when compared with that in the control group.The expressions of Bax was significantly downregulated (P<0.05),while the expressions of Bcl-2 was significantly upregulated (P<0.05) in the simvastatin 24 h and simvastatin 48 h groups when compared with that in the control group.The expression of Bcl-2 of PMECs in the simvastatin 48 h group was significantly increased (P<0.05) compared to the simvastatin 24 h group.ConlusionsSimvastatin improves the growth of PMECs incubated with serum of NPE rat.One of the corresponding mechanisms may be related to the upregulation of Bcl-2 and downregulation of Bax.

simvastatin; neurogenic pulmonary edema; pulmonary microvascular endothelial cells; Bax； Bcl-2

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.05.008

2015-03-25；

2015-05-28

湖南省科技計劃項目(2014SK3088)；湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題項目(B2013-040).

*通訊作者，E-mail：13973417900@163.com.

R741.02

A

(此文編輯：蔣湘蓮)