葛寶坤，李淑靜，婁婷婷，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

直接稀釋-HPLC法快速測定鮮橙中的有機酸和VC

葛寶坤，李淑靜*，婁婷婷，鄭文杰

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

采用流動相（乙腈-磷酸鹽緩沖液，PH=2.3）為稀釋液，建立了樣品直接稀釋、高效液相色譜（HPLC）分離、二極管陣列檢測器（PDA）檢測，同時快速測定鮮橙中的酒石酸、VC、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、蘋果酸的可靠方法。該方法以保留時間（Rt）定性，外標(biāo)法定量；7種組分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5；樣品在0.2、0.5、5.0g/kg3個加標(biāo)水平的平均回收率為92%～104%（n=10），相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.9%；方法的定性檢出限（LOD）為0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量檢出限（LOQ）為0.05 g/kg～0.2 g/kg。

直接稀釋法；HPLC；PDA；鮮橙；有機酸；VC

鮮橙營養(yǎng)豐富，富含VC和有機酸。VC又稱抗壞血酸，是人體必須的維生素之一，它有利于提高人體免疫力[1]，防止人體衰老，降低膽固醇等作用[2]，因此測定鮮橙中的VC的含量，對評價其營養(yǎng)價值具有重要意義；橙汁的品質(zhì)不僅取決于鮮橙的出汁率、固形物、含糖量、含酸量等因素，還取決于鮮橙的口感及風(fēng)味，由于有機酸的種類和含量是決定鮮橙風(fēng)味、口感和品質(zhì)的重要因素之一；另外，有機酸還具有抗癌、鎮(zhèn)痛等功能[3]，因此有機酸的分析測定對鑒定鮮橙的真?zhèn)?、產(chǎn)地尤為重要，也為人們更好地選擇優(yōu)質(zhì)的鮮橙提供依據(jù)。因此分析測試鮮橙中的有機酸和VC，對確定其特征酸及其含量，建立鮮橙中有機酸和VC的指紋圖譜對鑒別鮮橙的真?zhèn)渭捌鋪碓达@得尤為重要。液相色譜法同時測定鮮橙中有機酸和VC的方法未見報道，同時測定沙棘汁和酸棗中的有機酸和VC的文獻已有報道[4-6]，上述文獻或存在僅靠色譜條件不能將VC與D-蘋果酸很好地分離而造成蘋果酸的測定結(jié)果偏高，或采用較為繁瑣的2次進樣分別測定有機酸和VC。目前，測定有機酸和VC的方法主要有滴定法[7-8]、分光光度法[9]、離子色譜法[10]、氣相法[11-12]、氣質(zhì)法[13-14]、液相法[5，15-18]、液質(zhì)質(zhì)法[19]；滴定法僅適用于總酸的常量分析；比色法的精密度差、靈敏度低；氣相法和氣質(zhì)法均需衍生和干燥，操作復(fù)雜且易破壞有機酸和VC，液質(zhì)質(zhì)法需要昂貴的設(shè)備。綜上，研究并建立了采用直接稀釋前處理、HPLC分離、PDA檢測器檢測、一次進樣可同時檢測鮮橙中的6種有機酸和VC的方法，該方法簡便、快速、靈敏、重現(xiàn)性好，可供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀：Waters公司，配2998型二極管陣列檢測器；MILLI-Q純水儀：MILLIPORE公司；HITACHI CR22G III型高速離心機。

1.2 試劑

乙腈：色譜純；磷酸：優(yōu)級純，含量≥85%，天津化學(xué)試劑三廠；磷酸二氫鈉：優(yōu)級純，天津永大化學(xué)試劑開發(fā)中心，含量≥99%；流動相：0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（pH=2.3）：乙腈=99∶1；混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：準(zhǔn)確稱取的酒石酸125mg、VC50mg、乳酸250mg、乙酸250mg、檸檬酸250mg、琥珀酸375mg、蘋果酸25mg標(biāo)準(zhǔn)品（均為CHEM SRVICE公司生產(chǎn)，含量均≥99.5%），用流動相溶解、混勻、定容，即為標(biāo)準(zhǔn)儲備液，標(biāo)準(zhǔn)使用液是將儲備液用流動相稀釋至所需要的濃度。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

鮮橙去皮，采用積壓方式取出橙汁，混勻，取橙汁1.0 g（精確至0.01 g）于15mL離心管中，用流動相直接稀釋定容至10mL，混勻，4℃、10000 r/min離心10min，上清液過0.45μm濾膜進液相色譜儀分析測定。

1.3.2 高效液相色譜條件

色譜柱：迪馬公司，Diamonsil C8 250mm×4.6mm，5μm，或相當(dāng)者；恒流速：0.6mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；波長：214 nm。

1.3.3 分析測定

根據(jù)樣液中被測組分的含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液進行校正，Rt結(jié)合PDA光譜圖定性、峰面積定量，在色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖、樣品色譜圖及待測組分的保留時間見圖1。

1.3.4 實際樣品檢測

對來自四川、云南、湖北、重慶、江西、廣西、福建七個產(chǎn)地的冰糖橙、錦橙、血橙、伏令夏橙、早金甜橙、倫晚臍橙、耐濕臍橙等18個品種的鮮橙進行了有機酸和VC的含量檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相pH對分離效果的影響

研究了流動相的pH分別為1.8、2.0、2.3、2.5和3.0條件下對測定結(jié)果的影響，研究表明：當(dāng)pH為1.8、2.0、2.3時，對分離效果的影響無顯著性差異，而當(dāng)pH為2.5和3.0時，琥珀酸和蘋果酸不能實現(xiàn)很好的分離，同時考慮色譜柱的壽命和分離效果，本研究中磷酸鹽緩沖液的pH選擇2.3。

2.2 吸收波長的選擇

對有機酸最大吸收波長210 nm、214 nm和VC的最大吸收波長245 nm進行了對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有機酸在吸收波長214 nm和其最大吸收波長210 nm的響應(yīng)值差別較小，而VC在214 nm吸收波長時的響應(yīng)值比最大吸收波長245 nm時的響應(yīng)值減少了3倍。但是，VC的檢測靈敏度是鮮橙中主要有機酸檸檬酸的5倍，因此，選取214 nm為本研究的最佳吸收波長。圖1為有機酸和VC的色譜圖。

圖1液相色譜圖Fig.1 LC chromatograms of the mixed standard solution（a）and sample（b）

2.3 方法的線性范圍和相關(guān)系數(shù)

用流動相將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度在0.02mg/mL～3.75mg/mL的范圍內(nèi)，按照優(yōu)化的色譜條件進行線性分析，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以目標(biāo)物質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo)（X）繪制工作曲線，結(jié)果表明7種有機酸在0.02mg/mL～3.75mg/mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，結(jié)果見表1。2.4 方法的回收率與精密度

表1 方法的靈敏度、線性關(guān)系及回收率（n=6）Table 1 Sensitivities，linear ships and recoveries of the method（n=6）

取鮮榨橙汁（按1.3.1操作）1 g（精確到0.01 g），按照0.2、0.5、5.0 g/L 3個加標(biāo)水平進行加標(biāo)回收試驗，結(jié)果為7種成分的平均回收率92%～104%（n=10），精密度小于2.0%，本方法的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表1。

2.5 方法的測定限

按上述樣品制備方法取系列樣品，由高到底依次加入系列混合標(biāo)液，按照本試驗方法和色譜條件分析測定，根據(jù)選擇合適的噪比S/N=10時的加標(biāo)濃度計算本方法的定量限（LOQ）值，信噪比S/N=3時的加標(biāo)濃度計算本方法的定性限（LOD）值，結(jié)果見表1。

2.6 方法的適用性

為了確定方法的抗干擾能力及適用性，分別選取鮮橙中常見的檸檬黃、日落黃，按照本方法條件進行添加干擾測試，結(jié)果顯示7種待測組分的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，符合分析方法的要求。

2.7 實際樣品測試

按照本研究方法，對來自四川、云南、湖北、重慶等8個產(chǎn)地的29個不同品種的鮮橙進行了有機酸和VC的檢測結(jié)果見表2。

VC的含量為0.2 g/kg～1.1 g/kg，酒石酸含量為0.2 g/kg～0.8 g/kg，檸檬酸為4.5 g/kg～21.9 g/kg，L-蘋果酸為0.4 g/kg～1.4 g/kg，僅有4個樣品檢出琥珀酸0.2 g/kg～0.3 g/kg采用本研究方法測得的結(jié)果與采用國標(biāo)方法、行標(biāo)方法測得鮮橙結(jié)果比較表明，二者的差別無顯著性，因此方法準(zhǔn)確可靠，適用性較強。

表2 18種來自不同產(chǎn)地鮮橙中有機酸和VC的含量Table2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

續(xù)表2 18種來自不同產(chǎn)地鮮橙中有機酸和VC的含量Continue table 2 Content of organic acid and VCof orange from 18 different districts of China

3 結(jié)果

本研究的檢測方法7種待測組分在0.02mg/mL～3.75mg/mL的濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 8；樣品在0.2、0.5、5.0 g/L 3個加標(biāo)水平內(nèi)的回收率范圍為92%～104%，6次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.1%～2.9%；方法的定性檢出限（LOD）為0.02 g/kg～0.05 g/kg、定量檢出限（LOD）為0.05 g/kg～0.20 g/kg，符合色譜分析的方法要求。本研究方法具有操作簡單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱和昂貴的質(zhì)譜設(shè)備等特點，可供參考。

[1]聶懷鑫,王佃亮.維生素C的免疫功能及緩釋技術(shù)[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù),2013,8(5):380

[2]陳穎雅.維生素C對血糖、尿酸、三酰甘和總膽固醇的影響[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(30):524-525

[3]丁小娟,丁珊珊,呂凌,等.高效液相色譜同時測定宣木瓜中五種有機酸和原兒茶酸的含量[J].安徽醫(yī)藥,2013,17(9):1496-1498

[4]孫延芳,梁宗鎖,楊開寶,等.高效液相色譜法分析酸棗中的有機酸和維生素C[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科技,1998,17(8):80-82

[5]陸敏,張紹巖,張文娜,等.高效液相色譜法測定沙棘汁中7種有機酸[J].食品科學(xué),2012,33(14):235-237

[6]董彩霞,董園園,王健,等.同一流動相測定植物體內(nèi)12種有機酸和維生素C的高效液相色譜法[J].土壤學(xué)報,2005,42(2):331-335

[7] 雷成康,郭玲.山楂中有機酸含量測定方法的改進[J].中藥材, 2010,33(5):745-747

[8]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].一部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:22,54

[9]黃志先,戴仁澤.熒光分光光度法定量測定葡萄酒中的蘋果酸含量[J],食品發(fā)酵工業(yè),1985(6):26

[10]米順利,夏寧,黃麗,等.不同品種橙汁中有機酸和無機陰離子分析[J].食品工業(yè)科技,2012,31(12):123-126

[11]高蕓,朱曉蘭,楊俊,等.毛細管氣相色譜法分析獼猴桃中的有機酸[J].食品科學(xué),2007,28(1):273-275

[12]朱曉蘭,高蕓,蘇慶德.毛細管氣相色譜法測定番茄中的非揮發(fā)性有機酸、高級脂肪酸和低分子糖類[J].食品科學(xué),2004,25(9):152-157

[13]鄧從蕊.氣質(zhì)聯(lián)用分析葡萄酒中的有機酸[J].分析測試技術(shù)與儀器,1996,2(2):5-7

[14]賈春曉,毛多斌,趙瑪,等.氣相色譜-質(zhì)譜分析山楂果中的有機酸[J].化學(xué)研究與應(yīng)用,2004,16(3):435-439

[15]黃桂穎,白衛(wèi)東,楊幼慧,等.反相高效液相色譜法測定荔枝肉中10種有機酸[J].現(xiàn)代食品科技,2009,25(5):568-570

[16]高海燕,廖小軍,王善廣,等.反相HPLC測定發(fā)酵飲料中的有機酸條件優(yōu)化[J].分析化學(xué),2004,12(12):1645-1648

[17]郭燕,梁俊,李敏敏,等.高效液相色譜法測定蘋果果實中的有機酸[J].食品科學(xué),2012,30(2):227-230

[18]孔祥紅,付興隆,姚秉華,等.固相萃取-反相高效液相色譜法同時測定濃縮果汁中的11種有機酸[J].食品科技,2010,35(7):291-295

[19]王乃平,袁艷,江海燕,等.液質(zhì)聯(lián)用法同時測定廣山楂有機酸含量[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(10):77-78

The Method of Rapid Determination Tartaric Acid，VCby Direct Dilution-HPLC in Fresh Orange

GE Bao-kun，LI Shu-jing*，LOU Ting-ting，ZHENG Wen-jie
（Tianjin Entry-Exit Inspecion and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

A method was developed for simultaneous determination of tartaric acid，vitamin C，lactic acid，acetic acid，citric acid，succinic acid，and malic acid in fresh orange.The sample was diluted directly by mobile phase（acetonitrile-NaH2PO4buffer solution，pH=2.3），and then analyzed by high-performance liquid chromatography（HPLC）with diode array detector（PDA）.The method for qualitative analysis was based on retention time.And external standard method was used for calculation.Good linear relationship was achieved in the range of 0.02 mg/mL-3.75 mg/mL for the 7 components with correlation coefficients above 0.999 5.The recoveries of the method ranged from 92%to104%（n=10）with the relative standard deviations（RSDs）among 1.1%-2.9%at3 spiked levels of 0.2，0.5，5.0 g/kg.The limit of detection （LOD）of this method is among 0.02 g/kg-0.05 g/kg for the 7 components，while the limit of quantification （LOQ）was0.05 g/kg-0.2 g/kg for the7 components.This is a simple，rapid，sensitive method for detection of organic acid and VC.

directdilution；HPLC；PDA；fresh orange；organic acid；VC

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.023

2014-10-23

國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項（201310146）

葛寶坤（1968—），男（漢），研究員，本科，研究方向：殘留分析與食品添加劑檢測技術(shù)。

*通信作者：李淑靜，高級工程師，博士。