林樹海 ， 蔡宗葦

（香港浸會大學(xué)化學(xué)系，環(huán)境與生物分析國家重點實驗室，香港999077）

對于分化了的細(xì)胞而言，在氧氣充足情況下，可通過糖酵解進(jìn)入三羧酸循環(huán)，實現(xiàn)葡萄糖的完全氧化，產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（ATP）。只有在氧氣不足的時候，才依賴于糖酵解通路產(chǎn)能，并產(chǎn)生大量的乳酸。但腫瘤細(xì)胞顯然不同。腫瘤是一種異質(zhì)性疾病，是細(xì)胞在失控條件下瘋狂生長，從而影響人體健康的一類惡性疾病。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的代謝差異早在20 世紀(jì)20 年代就引起德國科學(xué)家奧托-瓦伯格（Otto Warburg）的注意。他通過物理化學(xué)方法，檢測了腫瘤組織與正常組織在泌酸與耗氧方面的差異，總結(jié)出瓦伯格效應(yīng)（Warburg effect）［1，2］。該效應(yīng)提出如下假說：腫瘤細(xì)胞主要依賴于糖酵解通路獲得能量，不管氧氣是否存在及氧含量多少，都產(chǎn)生過量的乳酸（如圖1 所示）。雖然糖酵解通路是一條效率低下的產(chǎn)能通路，這種能量供應(yīng)方式也被稱為需氧糖酵解。這項假說提出以后，有長達(dá)數(shù)十年被人們所遺忘，直到20 世紀(jì)90 年代才開始有人重新研究瓦伯格效應(yīng)。對瓦伯格效應(yīng)的理解也逐步深入，并從糖代謝衍生到其他代謝，比如谷氨酰胺代謝、脂代謝等［3，4］。

1 碳-13 標(biāo)記的示蹤分析

圖1 氧氣（a）充足和（b）不足時的糖酵解［3］Fig.1 Glycolysis under （a）high and （b）limited oxygen conditions［3］

為了更好地理解腫瘤代謝的變化規(guī)律，我們需要一種新的檢測方法。同位素標(biāo)記的示蹤分析方法就是讓癌細(xì)胞攝取含有同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物質(zhì)，如葡萄糖、谷氨酰胺等，然后檢測其他中間代謝產(chǎn)物的同位素標(biāo)記情況，反映出癌細(xì)胞中的代謝調(diào)控［5］。在細(xì)胞培養(yǎng)中，可以先用全碳-13 標(biāo)記的葡萄糖與沒有同位素標(biāo)記（碳-12）的谷氨酰胺混合，共同在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一段時間（比如24 h），然后收集細(xì)胞并提取代謝物做代謝流分析（如圖2 中所示的紅色標(biāo)記的碳-13）。另一種情況就是采用全碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺與沒有同位素標(biāo)記（碳-12）的葡萄糖混合，共同在細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞一段時間，所得細(xì)胞代謝物用于代謝流分析（如圖2 中所示的藍(lán)色標(biāo)記的碳-13）。利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜可以提高分析的靈敏度與選擇性。在不同的代謝反應(yīng)中，同一代謝物因含不同數(shù)目的碳-13 標(biāo)記，母離子與子離子質(zhì)荷比也不同。經(jīng)優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)后定量分析，可判別細(xì)胞中的代謝切換。例如，含有4 個碳-13 的蘋果酸可來源于谷氨酰胺氧化代謝通路，而含3 個碳-13 的蘋果酸則可來源于谷氨酰胺還原代謝通路?，F(xiàn)以著名的癌基因Kras 為例來討論糖代謝與谷氨酰胺代謝。Kras 是一個重要基因，在腫瘤細(xì)胞生長、增殖以及血管生成等過程的信號傳導(dǎo)通路中起著“開關(guān)”作用，從而影響腫瘤的生長和擴散。Ying 等［6］采用碳-13 標(biāo)記的葡萄糖培養(yǎng)癌基因Kras 高表達(dá)的癌細(xì)胞，然后通過質(zhì)譜檢測含有碳-13 的中間代謝物，包括糖酵解通路與三羧酸循環(huán)。這種同位素標(biāo)記示蹤分析技術(shù)可判別代謝的速率和方向的改變。后來又進(jìn)一步采用碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺培養(yǎng)癌細(xì)胞，也同樣檢測碳-13 標(biāo)記的代謝物［7］。有趣的是，從谷氨酰胺進(jìn)入三羧酸循環(huán)有兩條通路，一條是氧化代謝途徑，另一條是還原反應(yīng)代謝途徑。如圖2 所示，質(zhì)譜技術(shù)檢測到的三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物，其碳源可能有3 條途徑；一條是糖酵解；一條是在線粒體中進(jìn)行的谷氨酰胺氧化代謝；另一條則是在胞漿中進(jìn)行的谷氨酰胺還原代謝?；谫|(zhì)譜的同位素示蹤技術(shù)體現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢，可定量分析細(xì)胞代謝的動態(tài)變化。這一分析技術(shù)越來越得到重視和廣泛應(yīng)用。再如新近《分子細(xì)胞》雜志報道的美國德州西南醫(yī)學(xué)中心DeBerardinis 博士課題組［8］的工作，他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)線粒體的丙酮酸運載體失活的時候，谷氨酰胺的氧化代謝即可保持三羧酸循環(huán)運轉(zhuǎn)并維持細(xì)胞存活。線粒體的丙酮酸運載體是從葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)中的一個關(guān)鍵蛋白。這個關(guān)鍵蛋白的活性一旦異常，會影響到葡萄糖代謝。但令人驚訝的是，谷氨酰胺代謝即可起到替代作用。從圖2 中還可以看到，谷氨酰胺進(jìn)入細(xì)胞，代謝成谷氨酸，進(jìn)而脫氨生成α-酮戊二酸。DeBerardinis 課題組［9］還報道了在線粒體缺失的腫瘤細(xì)胞中，谷氨酰胺還原代謝同樣是需要的，并且這種還原代謝與α-酮戊二酸的氧化代謝同等重要，也就是說腫瘤細(xì)胞中可利用三羧酸循環(huán)的雙重代謝來實現(xiàn)快速增殖所需要的能量需求。這從本質(zhì)上講，谷氨酰胺代謝早已超出瓦伯格效應(yīng)的研究范疇，打破了過去一直認(rèn)為的腫瘤細(xì)胞的線粒體不活躍的說法。

除了葡萄糖、谷氨酰胺之外，代謝組學(xué)結(jié)合同位素標(biāo)記的示蹤分析可鑒定其他重要的代謝物。2012年《科學(xué)》雜志就報道了代謝組學(xué)與碳-13 標(biāo)記的示蹤技術(shù)鑒定出甘氨酸在60 種腫瘤細(xì)胞株中對促進(jìn)細(xì)胞生長起到重要作用［10］。今年5 月《細(xì)胞報道》［11］和9 月的《癌發(fā)現(xiàn)》［12］又分別提出另一代謝物絲氨酸可能比甘氨酸更重要，特別是進(jìn)入一碳代謝后更容易促進(jìn)細(xì)胞增殖與生長。由此可見，同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)這一分析化學(xué)方法在判別腫瘤細(xì)胞的代謝變化規(guī)律時有獨特的優(yōu)勢。

2 氘代標(biāo)記的示蹤分析

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是一種極為重要的核苷酸類輔酶，它是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）中與腺嘌呤相連的核糖環(huán)系2′-位的磷酸化衍生物，參與多種合成代謝反應(yīng)，如脂類、脂肪酸和核苷酸的合成。這些反應(yīng)中需要還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作為還原劑、氫負(fù)供體，NADPH 是NADP＋的還原形式。NADPH 對細(xì)胞生長與增殖、抗氧化都具有重要意義［13］。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院吳緬教授與美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院楊小魯教授合作，在癌癥代謝機制研究中取得一項新的突破性發(fā)現(xiàn)，即證實p73 蛋白激活了癌細(xì)胞中的磷酸戊糖途徑，支持了腫瘤細(xì)胞的增殖［14］。吳緬和楊小魯課題組經(jīng)過多年合作研究發(fā)現(xiàn)，p73 是通過一條葡萄糖代謝旁路即磷酸戊糖途徑，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。他們通過實驗證明，高表達(dá)的p73 使葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）這一關(guān)鍵酶的活性大大增強，從而激活了在正常細(xì)胞中較少被使用的代謝旁路，即磷酸戊糖途徑，細(xì)胞中大量的葡萄糖通過這一旁路被消耗。這一代謝途徑無法產(chǎn)生細(xì)胞生長必需的能量，而是產(chǎn)生大量戊糖與強還原劑NAPDH，前者用于合成核苷酸，后者則會參與脂肪酸合成和清除一種對腫瘤細(xì)胞有抑制作用的氧化物，即活性氧自由基（reactive oxygen species：ROS），從而滿足腫瘤細(xì)胞無限、旺盛的生長。

圖2 全碳-13 標(biāo)記的葡萄糖與未標(biāo)記谷氨酰胺培養(yǎng)的癌細(xì)胞，以及未標(biāo)記葡萄糖與全碳-13 標(biāo)記的谷氨酰胺培養(yǎng)的癌細(xì)胞的代謝通路Fig.2 Metabolic pathways in cancer cells fed with［U-13 C6］-glucose and unlabeled glutamine or unlabeled glucose and［U-13C5］-glutamine

為了分析檢測代謝底物轉(zhuǎn)化為NADPH 的動態(tài)變化，今年6 月和7 月的《自然》［15］與《分子細(xì)胞》［16］分別報道了基于質(zhì)譜的氘代示蹤技術(shù)定量分析細(xì)胞中不同代謝通路產(chǎn)生NADPH 的差異與動態(tài)規(guī)律。目前普遍認(rèn)為哺乳細(xì)胞中有約60%的NADPH 來自磷酸戊糖途徑，但新的研究表明，在某些腫瘤細(xì)胞中，磷酸戊糖途徑與蘋果酸酶約各貢獻(xiàn)30%的NADPH，而一碳代謝卻產(chǎn)生約40%的NADPH。這意味著一碳代謝可能更重要。為了進(jìn)一步在細(xì)胞中定位（區(qū)域化），可采用氘代的方法標(biāo)記營養(yǎng)物并用于細(xì)胞培養(yǎng)中。絲氨酸與甘氨酸作為一碳代謝的前體代謝物，可經(jīng)由一碳代謝產(chǎn)生NADPH。在細(xì)胞培養(yǎng)中，Lewis 等［16］用［2，3，3-2H3］標(biāo)記的絲氨酸追蹤檢測［2H］-NADPH，發(fā)現(xiàn)絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸這一過程在線粒體中的絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶2 催化下產(chǎn)生NADPH（見圖3a）；另外，用類似的辦法，用［2，2-2H2］標(biāo)記甘氨酸發(fā)現(xiàn)甘氨酸可以通過甘氨酸脫羧酶催化產(chǎn)生NADPH（見圖3b）。

圖3 線粒體中的一碳代謝［16］Fig.3 One-carbon metabolism in mitochondria［16］

3 前景展望

穩(wěn)定同位素標(biāo)記稀釋技術(shù)很早就被用作內(nèi)標(biāo)，但細(xì)胞攝取同位素標(biāo)記的營養(yǎng)物，根據(jù)生物化學(xué)反應(yīng)規(guī)律探尋該同位素的轉(zhuǎn)歸則是分析化學(xué)與生物化學(xué)相結(jié)合產(chǎn)生的一門新興技術(shù)方法。目前采用最多的是碳-13 標(biāo)記，用于分析細(xì)胞代謝物的碳源差異。本文重點討論的是碳-13 標(biāo)記與氘代標(biāo)記的示蹤分析技術(shù)用于定量分析細(xì)胞代謝中不同通路的差異。其中氘代示蹤分析技術(shù)改變了生物化學(xué)中傳統(tǒng)的觀點，即NADPH 約60%來源于磷酸戊糖途徑。實際上可能沒那么多來自磷酸戊糖途徑，至少在腫瘤細(xì)胞中如此。一碳代謝的重要性必須得到重視，其對腫瘤細(xì)胞而言可能更為重要。未來的研究可能還將采用氮-15 標(biāo)記分析氨基酸和核苷的合成規(guī)律，對深入理解細(xì)胞中的生物化學(xué)反應(yīng)提供重要證據(jù)。這也是代謝組學(xué)，特別是代謝流分析技術(shù)帶來的優(yōu)勢。

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