卞英芳， 于莎莎， 牟仁祥， 曹趙云， 孫偉華， 楊 歡， 林曉燕， 陳銘學(xué)

（中國水稻研究所，農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，農(nóng)業(yè)部稻米產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州310006）

稻曲病是一種水稻真菌病害，由綠核菌屬綠核菌Ustilaginodea virens （Cooke）Takahashi 侵染水稻穗部引起，遍布世界各產(chǎn)稻區(qū)［1-3］。近年來，稻曲病已由過去的零星分布轉(zhuǎn)變成為水稻主要病害之一［4］，不僅嚴(yán)重危害谷粒生長，降低水稻的產(chǎn)量與品質(zhì)，而且稻曲病菌所產(chǎn)生的稻曲病菌毒素對(duì)人畜也具有毒害作用［5-7］。據(jù)報(bào)道，稻曲病菌毒素能夠阻止細(xì)胞微管蛋白的聚合，干擾細(xì)胞骨架的形成，并可抑制細(xì)胞有絲分裂，導(dǎo)致動(dòng)物內(nèi)臟發(fā)生病變［8，9］。有研究表明，不同稻曲病菌毒素的毒理存在差異，因此，準(zhǔn)確鑒定稻曲病菌毒素才能科學(xué)、客觀地對(duì)稻曲病污染稻米質(zhì)量安全做出評(píng)價(jià)，并開展相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估工作。

目前已明確稻曲球中存在ustiloxin A、ustiloxin B、ustiloxin C、ustiloxin D 和ustiloxin F 5 種稻曲病菌毒素，但現(xiàn)有檢測方法主要局限于ustiloxin A、ustiloxin B、ustiloxin D 中的一種或兩種毒素的研究［10-13］，而關(guān)于多種稻曲病菌毒素的同步檢測方法尚未見報(bào)道。主要原因是免疫標(biāo)記法、高效液相色譜法及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等傳統(tǒng)檢測分析方法都依賴標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定性定量分析，而稻曲病菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品尚無商品化供應(yīng)。Koiso等［14，15］采用多次柱層析方法自稻曲球中分離純化出5 種單一稻曲病菌毒素，但該方法過程復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，分離純化效率低，限制了稻曲病菌毒素的深入研究。因此如何實(shí)現(xiàn)從組分復(fù)雜的樣品中快速分離、鑒定出目標(biāo)物，成為快速準(zhǔn)確分析稻曲病菌毒素的主要技術(shù)難題。

本文在參考文獻(xiàn)［9，13，15］基礎(chǔ)上，利用LTQ-Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合質(zhì)譜解析軟件［16-18］，對(duì)稻曲球水提取液進(jìn)行了直接質(zhì)譜分析，鑒定分析出5 種稻曲病菌毒素；基于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性以及對(duì)目標(biāo)物痕量分析的要求，本實(shí)驗(yàn)采用了PCX 混合陽離子交換柱固相萃取凈化方法，結(jié)合優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件，成功地建立了高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分離和鑒定5 種稻曲病菌毒素的方法，并應(yīng)用此方法對(duì)不同生長時(shí)期的稻曲球進(jìn)行了毒素含量變化趨勢分析。本方法簡便、快速、靈敏度高、定性準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

Survryor 系列液相色譜儀（美國ThermoFisher公司）、LTQ-Orbitrap 組合高分辨質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher 公司）、高速勻漿機(jī)（德國IKA 公司）、Primo R 離心機(jī)（美國ThermoFisher 公司）、Bond Elut Plexa PCX 混合陽離子交換柱（60 mg／3 mL，美國Agilent 公司）。

1.2 試劑與材料

甲醇（色譜純，Merck 公司），甲酸（色譜純）、二氯甲烷（農(nóng)殘級(jí)）（Tedia 公司），氨水（含量25%～28%，杭州長征化學(xué)試劑有限公司）；實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q 高純水。

于中國水稻研究所水稻試驗(yàn)田剪取稻曲球樣品，放于密封袋，并冷凍保存于-40 ℃冰箱中。

1.3 稻曲病菌毒素的分析

1.3.1 樣品前處理

稱取2.00 g 待測稻曲球樣品于50 mL 離心管中，加入10 mL 水，于高速勻漿機(jī)中以17 500 r／min的轉(zhuǎn)速高速勻漿1 min，超聲提取10 min；再加入等體積的二氯甲烷充分振搖，于7 000 r／min 下離心15 min，使其分層；收集600 μL 上清液，加入350 μL 水和50 μL 甲酸，混勻，待凈化。

1.3.2 凈化

將PCX 混合陽離子交換柱用2 mL 5%（v／v）甲酸水溶液條件化，待液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)立即加入上述待凈化液，依次用2 mL 5%（v／v）甲酸水溶液和5%（v／v）甲醇水溶液淋洗小柱，最后用2 mL 5%（v／v）氨水甲醇溶液洗脫；收集洗脫液于5 mL 玻璃試管中，在50 ℃下氮?dú)鉂饪s至近干，最后用0.1%（v／v）甲酸水溶液定容至1 mL，渦旋混勻，并經(jīng)0.22 μm 水相濾膜過濾后上機(jī)待測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Xselect HSS T3（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：5.0 μL；流動(dòng)相：A 相為0.1%（v／v）甲酸水溶液，B 相為甲醇；流速：150 μL／min；梯度洗脫程序：0～5.00 min，90%A；5.00～20.00 min，90%A～20%A；20.00～20.10 min，20%A～10% A；20.10 ～25.00 min，10% A；25.00 ～25.10 min，10%A～90%A；25.10～35.00 min，90%A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描模式：全掃描；掃描范圍：m／z 200 ～1 000；質(zhì)譜分辨率：100 000；裂解模式：碰撞誘導(dǎo)解離（CID）；鞘氣（N2）壓力：241.33 kPa；輔助氣（N2）壓力：34.48 kPa；毛細(xì)管溫度：350 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻曲病菌毒素的鑒定

目前，已報(bào)道的稻曲病菌毒素有5 種，分別是稻曲病毒素A、B、C、D、F，其結(jié)構(gòu)式如圖1 所示。該類毒素屬于環(huán)肽類化合物，具有共同骨架結(jié)構(gòu)：一個(gè)13 元環(huán)內(nèi)含一個(gè)醚鍵、一個(gè)羧基以及多個(gè)亞氨基。共同骨架結(jié)構(gòu)決定了其化學(xué)性質(zhì)的相似性，也體現(xiàn)了毒素之間具有一定的關(guān)聯(lián)性，從而有利于物質(zhì)的鑒定分析［15］。

圖1 5 種毒素的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of the five ustiloxins

將采集的樣品按1.3 節(jié)方法處理后，參考文獻(xiàn)［9，12，13，15，19］，對(duì) 稻 曲 球 提 取 液 進(jìn) 行HPLC-LTQ／Orbitrap MS 分析，通過高分辨質(zhì)譜的全掃描質(zhì)譜圖、母離子的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比和二級(jí)裂解規(guī)律進(jìn)行總結(jié)和分析。結(jié)果表明：5 種毒素在正離子模式下形成［M＋H］＋離子峰，準(zhǔn)分子離子峰和同位素豐度比與理論質(zhì)量數(shù)和理論豐度比基本一致，二級(jí)質(zhì)譜得到的離子碎片和文獻(xiàn)基本吻合。

2.1.1 準(zhǔn)分子離子峰的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)

采用高分辨質(zhì)譜全掃描模式對(duì)樣品進(jìn)行質(zhì)譜采集，參考已發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)稻曲球樣品成分進(jìn)行初步歸類。表1 列舉了樣品中稻曲病菌毒素的質(zhì)譜信息，其中包括各稻曲病菌毒素的保留時(shí)間、高分辨母離子、準(zhǔn)確相對(duì)分子質(zhì)量等相應(yīng)信息?？梢钥闯觯? 種組分的準(zhǔn)分子離子的實(shí)際測定質(zhì)量數(shù)與其理論質(zhì)量數(shù)基本一致，其質(zhì)量誤差絕對(duì)值在0.4×10-6～0.9×10-6（0.4～0.9 ppm）之間，在允許范圍之內(nèi)（＜5 ppm）。

2.1.2 同位素豐度比值的分析

本文還考察了5 種毒素實(shí)際測定的同位素豐度比值，并與依據(jù)同位素組成與分布軟件［20］查到的理論同位素豐度比值相比較，結(jié)果（表2）表明，（M＋1）／M 和（M＋2）／M 的相對(duì)豐度偏差均符合歐盟關(guān)于質(zhì)譜分析質(zhì)量控制和確證程序的要求［21］。

表1 5 種毒素的HPLC-LTQ／Orbitrap MS 分析參數(shù)Table 1 HPLC-LTQ／Orbitrap MS analysis parameters of the five ustiloxins

表2 5 種毒素的同位素相對(duì)豐度Table 2 Relative abundances of the five ustiloxins

2.1.3 稻曲病菌毒素的二級(jí)質(zhì)譜分析

為了進(jìn)一步確認(rèn)該5 種組分是否為稻曲病菌毒素，實(shí)驗(yàn)對(duì)其二級(jí)質(zhì)譜行為進(jìn)行了考察分析。對(duì)5種稻曲病菌毒素準(zhǔn)分子離子［M＋H］＋進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，通過對(duì)碰撞能量、方式等條件的優(yōu)化，確定了5 種毒素［M＋H］＋的子離子，并與國內(nèi)外已發(fā)表文獻(xiàn)［13，22，23］中的稻曲病菌毒素子離子進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果（見表3）發(fā)現(xiàn)除了尚未有研究報(bào)道的ustiloxin C外，其他4 種毒素子離子分別與文獻(xiàn)報(bào)道相對(duì)應(yīng)。由碎片離子可以看出，ustiloxin C 與其他4 種毒素的斷裂規(guī)律基本一致，結(jié)合共同化學(xué)結(jié)構(gòu)，確證為ustiloxin C。

應(yīng)用質(zhì)譜裂解理論并結(jié)合Mass Frontier 質(zhì)譜解析軟件，模擬考察了5 種稻曲病菌毒素在質(zhì)譜中的裂解規(guī)律。發(fā)現(xiàn)模擬得到的碎片離子和利用CID-MS／MS 技術(shù)得到的碎片離子（見圖2）基本吻合。

表3 5 種毒素在CID 裂解模式下質(zhì)譜產(chǎn)生的碎片離子Table 3 Ion information of the five ustiloxins acquired by mass spectrometry in collision induced dissociation （CID）mode

圖2 ustiloxin D 的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS／MS spectrum of ustiloxin D

2.2 凈化條件的優(yōu)化

基于復(fù)雜樣品基質(zhì)對(duì)儀器檢測的干擾，本研究結(jié)合5 種待測目標(biāo)物的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用酸性條件下可帶正電的特性，選用PCX 混合陽離子交換柱固相萃取凈化方法，分別考察了凈化液及洗脫劑中酸堿含量對(duì)5 種稻曲病菌毒素分離的影響。

以5%（v／v）氨水甲醇溶液為洗脫劑，考察了凈化液中甲酸含量（0、1%、5%、10%和15%，均為體積分?jǐn)?shù)）對(duì)5 種毒素凈化的影響。如圖3a 所示，凈化液中甲酸的含量對(duì)5 種毒素的凈化效果影響較大，其中以u(píng)stiloxin C 和ustiloxin F 最為敏感，酸度過高或過低其凈化效果都不好；當(dāng)甲酸含量為5%時(shí)，5 種毒素的總體過柱回收率最好，為94.2% ～101.4%。因此實(shí)驗(yàn)選擇凈化液中甲酸含量為5%（v／v）。

在上述優(yōu)化條件基礎(chǔ)上，本文進(jìn)一步考察了不同氨水含量（0、1%、5%、10%和15%，均為體積分?jǐn)?shù)）的洗脫劑對(duì)5 種毒素凈化效果的影響。如圖3b 所示，當(dāng)氨水含量為0 時(shí)，無目標(biāo)物檢出；當(dāng)氨水含量≥1%時(shí)，5 種毒素的過柱回收率均達(dá)到90%以上，幾乎全部毒素被洗脫。綜合考慮PCX 小柱的個(gè)別差異、實(shí)際樣品的復(fù)雜性以及實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性，本文選擇5%（v／v）氨水甲醇溶液為樣品洗脫劑。

2.3 不同生長時(shí)期稻曲球中毒素的鑒定分析

圖3 （a）凈化液中甲酸含量和（b）洗脫劑中氨水含量對(duì)5 種毒素凈化效果的影響（n＝3）Fig.3 Effects of （a）formic acid content in the purificant and （b）ammonia hydroxide content in the eluent on the purification of the five ustiloxins （n＝3）

圖4 不同時(shí)期稻曲球樣品中5 種毒素的響應(yīng)峰面積（n＝3）Fig.4 Peak areas of the five ustiloxins in false smut balls at different periods （n＝3）

參考稻曲球生長規(guī)律，將稻曲球隨顏色的變化分為早期（黃色）、中期（黃綠色）和晚期（墨綠色）3個(gè)時(shí)期，利用本文建立的方法對(duì)3 個(gè)不同時(shí)期的稻曲球樣品進(jìn)行檢測，研究分析5 種毒素在稻曲球不同生長時(shí)期中的變化趨勢。如圖4 所示，在不同時(shí)期稻曲球中均鑒定到含有一定量的5 種稻曲病菌毒素；同一時(shí)期稻曲球中5 種毒素的色譜峰面積均存在明顯差異，峰面積以u(píng)stiloxin A 最大，ustiloxin C最小，表明稻曲球中5 種毒素的含量差異明顯，且以u(píng)stiloxin A 為主要成分，該結(jié)果與尹小樂等［11］的研究結(jié)果一致；而在不同時(shí)期稻曲球中5 種毒素含量大小均表現(xiàn)為中期＞晚期＞早期，其中以u(píng)stiloxin A和ustiloxin B 差異最為明顯。綜上所述，稻曲球形成過程中均有稻曲病菌毒素的產(chǎn)生，并以u(píng)stiloxin A 為主；而毒素發(fā)生高峰期為稻曲球生長中期，推測其原因可能是稻曲球中期病菌生長代謝旺盛，毒素（次生代謝產(chǎn)物）產(chǎn)量最高。

圖5 為實(shí)際樣品中5 種稻曲病菌毒素的色譜圖，從中可以看出，采用本文建立的方法可使5 種稻曲病菌毒素均得到基線分離，且峰形良好，能滿足稻曲病菌的鑒定分析要求。

圖5 實(shí)際樣品中5 種毒素的色譜圖Fig.5 Chromatograms of the five ustiloxins in a sample

3 結(jié)論

本文采用HPLC-LTQ-Orbitrap MS 成功地鑒定到ustiloxins A、B、C、D 和F 5 種稻曲病菌毒素，解決了在缺乏相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品情況下難以對(duì)其分析的難題。針對(duì)復(fù)雜的樣品基質(zhì)，實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了PCX 小柱的凈化條件，得到以含5%（v／v）甲酸為凈化液和5%（v／v）氨水甲醇溶液為洗脫劑的實(shí)驗(yàn)條件。利用本文建立的方法對(duì)稻曲球樣品進(jìn)行了鑒定分析，結(jié)果表明，本方法簡便、快速、靈敏度高、定性準(zhǔn)確，適用于鑒定分析稻曲病菌毒素，并可為稻曲病菌毒素的后續(xù)相關(guān)研究提供高效、可靠的技術(shù)手段。

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