蔣婭蘭， 黃 芳， 毋福海 ， 吳惠勤， 黃曉蘭， 鄧 欣

（1. 廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東 廣州510006；2. 廣東藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州510024；3. 中國(guó)廣州分析測(cè)試中心，廣東省分析測(cè)試技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510070）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，味甘、苦、澀，性平，歸心、肺經(jīng)；具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂的功效。用于瘀血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳喘和高脂血癥。銀杏保健茶是一種具有保健功能的茶葉，采用紅茶作基茶，將銀杏葉提取物采用科學(xué)方法調(diào)配至茶葉中，在保證原茶葉的外觀、風(fēng)味不變的情況下，使茶葉的營(yíng)養(yǎng)更加豐富，能起到更好的保健作用，具有改善記憶力、清除氧自由基、改善心腦循環(huán)、延緩衰老的作用，且質(zhì)量穩(wěn)定，副作用小，可長(zhǎng)期食用。

銀杏葉提取物的有效成分主要為黃酮類化合物（flavonoids），茶葉中也含有黃酮類化合物。黃酮類化合物具有多方面的生物活性，如兒茶素具有抗脂肪肝作用及抗癌和維生素P 樣作用［1］；牡荊素具有活血化瘀、理氣通脈之功效，還是防癌抗腫瘤的天然藥物成分；木犀草素和黃芩素具有抗菌、降壓和清熱解毒的作用；槲皮素、山柰酚、異鼠李素、柚皮素、橙皮素具有抗氧化、抗炎癥、抗癌等生物活性［2-5］。

黃酮類化合物是自然界存在的一大類物質(zhì)，其種類多，在植物體內(nèi)大部分與不同的糖結(jié)合成苷，因此使得其更加復(fù)雜多樣，不易測(cè)定，建立合理的測(cè)定方法是分析工作中的難題。目前常用黃酮類物質(zhì)的測(cè)定方法有分光光度法［6］、高效液相色譜法（HPLC）［7，8］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9，10］。分光光度法只能測(cè)定總黃酮的含量，原理是通過(guò)顏色反應(yīng)后比色定量，實(shí)際測(cè)試過(guò)程中由于雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，導(dǎo)致定量準(zhǔn)確性差、重現(xiàn)性低；高效液相色譜法大多只對(duì)少數(shù)幾種黃酮進(jìn)行定量，且分離度要求高；有文獻(xiàn)采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用研究黃酮類物質(zhì)，但多數(shù)只著重于槲皮素、山柰酚、異鼠李素、兒茶素等少數(shù)幾種成分的定性鑒別或結(jié)構(gòu)確證［11］。本研究對(duì)常見(jiàn)的、功效明確的16 種黃酮及黃酮苷元（見(jiàn)表1），建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS／MS）同時(shí)測(cè)定該類物質(zhì)的方法，目前未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)測(cè)定發(fā)現(xiàn)銀杏保健茶中含量較高的9 種成分為山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荊素、木犀草素、兒茶素、芹菜素、柚皮素、異鼠李素，選擇這9 種成分作為質(zhì)控指標(biāo)符合現(xiàn)代保健品及中成藥多指標(biāo)質(zhì)量控制要求。該方法快速、準(zhǔn)確、抗干擾力強(qiáng)，可用來(lái)監(jiān)測(cè)保健茶的穩(wěn)定性及控制銀杏保健茶的質(zhì)量。

表1 16 種黃酮的分子式和相對(duì)分子質(zhì)量Table 1 Molecular formulae and relative molecular masses of the 16 flavonoids

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200 LC／6410B MS 液相色譜／串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent 公司）；Sartorious BP2HD 電子天平（美國(guó)Sartorious 公司）；HWS12型水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）。

對(duì)照品：兒茶素（批號(hào)110877-201203，純度97.2%）、葛 根 素（批 號(hào) 110752-200912，純 度95.5%）、牡荊素（批號(hào)111687-200602，純度100%）、大豆苷元（批號(hào)1502-200101，純度95.0%）、木犀草素（批號(hào)111520-200504，純度100%）、槲皮素（批號(hào)100081-200907，純 度 100%）、水 飛 薊 賓（批 號(hào)110856-200604，純度100%）、芹菜素（批號(hào)111901-201102，純度98%）、山柰酚（批號(hào)110861-201209，純度98.1%）、橙皮素（批號(hào)110721-201014，純度95.1%）、異 鼠 李 素（批 號(hào)110860-201109，純 度99.0%）、黃芩素（批號(hào)111595-201306，純度97.8%）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；川陳皮素（純度98%）、桔皮素（純度98%）和柚皮素（純度100%）、橙皮素二氫查爾酮（純度＞95%）購(gòu)自金測(cè)分析技術(shù)（天津）有限公司；銀杏保健茶（批號(hào)：130411、130421、130425、130429、130502、130513）購(gòu)自廣州悅榕醫(yī)藥科技有限公司；乙腈為色譜純（德國(guó)Merck 公司）；甲酸為L(zhǎng)C-MS 級(jí)（美國(guó)Sigma 公司）；甲醇、鹽酸為分析純（廣州化學(xué)試劑廠）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

分別取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度約500 mg／L 的對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于冰箱2-8 ℃保存（2 個(gè)月內(nèi)使用），臨用時(shí)用甲醇將上述儲(chǔ)備液稀釋為8 種不同濃度的混合對(duì)照品溶液。

1.3 供試品溶液的制備

實(shí)驗(yàn)參考了《中國(guó)藥典》2010 年版一部中銀杏葉提取物項(xiàng)下總黃酮苷的測(cè)定方法。取本品中粉約0.1 g，精密稱定，置于50 mL 圓底燒瓶中，精密加入甲醇-25%鹽酸溶液（4 ∶1，v／v）混合溶液10 mL，搖勻，90 ℃加熱回流60 min，放冷，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液4 mL 至10 mL 容量瓶中并加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)0.20 μm 微孔濾膜，濾液供HPLC-MS／MS測(cè)定。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2 μm）；流動(dòng)相：A 為乙腈，B 為0.1%（v／v，下同）甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～4 min，15%A～60% A；4 ～6 min，60% A ～80% A；6 ～7 min，80%A ～15% A；7 ～12 min，保持15% A。流速為0.25 mL／min；采集時(shí)間為12 min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧（ESI）離子源，正離子電離模式；干燥氣（N2）溫度350 ℃，流量10 L／min；霧化氣（N2）壓力275.8 kPa；電噴霧電壓4 000 V；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，各成分的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 16 種黃酮成分的保留時(shí)間及質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Retention times and HPLC-MS／MS parameters of the 16 flavonoids

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇配制質(zhì)量濃度分別為10、5、1、0.5、0.1、0.025、0.01、0.001 mg／L 的系列混合對(duì)照品溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用），上機(jī)測(cè)定。以定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定后以定量離子峰面積為指標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的選擇

本研究曾試驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定保健茶中的總黃酮［12］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用蘆丁作對(duì)照品時(shí)，采用不同提取溶劑（70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇）提取、聚酰胺柱凈化，得到的結(jié)果相差5 倍之多。分光光度法前處理過(guò)程長(zhǎng)，結(jié)果不穩(wěn)定，難以控制產(chǎn)品質(zhì)量。試驗(yàn)還參考《中國(guó)藥典》2010 年版一部中銀杏葉提取物項(xiàng)下測(cè)定總黃酮醇（包括槲皮素、山柰酚和異鼠李素），通過(guò)測(cè)定3 種物質(zhì)含量的和乘以系數(shù)2.51 得到總黃酮醇，該法只能測(cè)定這3 種物質(zhì)，不能全面地反映保健茶的質(zhì)量；本法將樣品水解后使不同結(jié)合態(tài)的黃酮苷轉(zhuǎn)變成幾種常見(jiàn)的苷元形式，再用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定，能定量多種黃酮類物質(zhì)，覆蓋面廣。比如測(cè)定水解液中的一種橙皮素，就代表原液中的橙皮苷、新橙皮苷［13］以及其他以橙皮素為苷元結(jié)合其他糖類的黃酮化合物，具有典型的代表性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

16 種黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)相似，需要選擇合適的色譜柱將其分離，尤其是其中3 對(duì)同分異構(gòu)體木犀草素和山柰酚（m／z 287）、芹菜素和黃芩素（m／z 271）、槲皮素和橙皮素（m／z 303）的分離，試驗(yàn)分別試用了不同型號(hào)的色譜柱：Thermo C8（150 mm×2.1 mm，2 μm）、Thermo C18（150 mm×2.1 mm，2 μm）和Agilent Zorbax C18（100 mm×2.1 mm，2 μm）色譜柱，結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示：Agilent Zorbax C18色譜柱對(duì)于各種物質(zhì)的分離效果比較理想。對(duì)比了A、B、C 3 種流動(dòng)相體系（A：乙腈-0.1%甲酸水溶液；B：乙腈-0.1%甲酸水溶液（含甲酸銨10 mmol／L）；C：甲醇-0.1% 甲酸水溶液（含甲酸銨 10 mmol／L）），結(jié)果表明，使用A 體系時(shí)各物質(zhì)靈敏度高、檢出限低，檢出限最低的川陳皮素和橘皮素能達(dá)到0.1 μg／L；使用B 體系時(shí)異構(gòu)體橙皮素和槲皮素不能分離；使用C 體系作流動(dòng)相時(shí)槲皮素的檢出限只能達(dá)到0.1 mg／L；綜合以上各因素，得到最佳色譜條件為：Agilent Zorbax C18色譜柱，乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫。在此條件下檢測(cè)得到16 種黃酮的MRM 圖如圖2 所示，其中木犀草素以保留時(shí)間為5.94 min 的峰進(jìn)行定量；槲皮素以保留時(shí)間為6.02 min 的峰進(jìn)行定量；山柰酚以保留時(shí)間為6.54 min 的峰進(jìn)行定量?；旌蠈?duì)照品溶液的16 種黃酮的總離子流色譜圖以及樣品溶液的16 種黃酮的總離子流色譜圖分別如圖3a、圖3b 所示，由于16 種黃酮中有3 對(duì)同分異構(gòu)體，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，因此要達(dá)到很好的分離度較難；另外，由于這3 對(duì)同分異構(gòu)體的相對(duì)分子質(zhì)量接近，所以保留時(shí)間集中在6.5～7.0 之間，對(duì)于其中相同的定量離子根據(jù)不同的保留時(shí)間來(lái)區(qū)分，如：木犀草素和山柰酚的定量碎片離子均為m／z 287＞153，而木犀草素的保留時(shí)間為5.94 min，山柰酚的保留時(shí)間為6.54 min，從而加以區(qū)分（圖3a 和圖3b 中峰1 和峰2 的保留時(shí)間稍有不同可能是因?yàn)楸镜谆|(zhì)效應(yīng)或者本底響應(yīng)值的差異導(dǎo)致的）。

圖1 3 種不同色譜柱分離的總離子流圖Fig.1 TIC of three kinds of column

圖2 16 種黃酮類化合物的MRM 譜圖Fig.2 MRM chromatograms of the 16 flavonoids

圖3 （a）16 種黃酮類化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及（b）樣品溶液的總離子流色譜圖Fig.3 TIC of （a）a mixed standard solution of the 16 flavonoids and （b）a sample solution

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

黃酮類化合物主要是基本母核為2-苯基色原酮的一系列化合物，母核上有-OH，-OCH3等不同取代基，而且結(jié)構(gòu)中具有堿性氧原子，因此選用ESI＋作為離子化模式，16 種黃酮均易得到一個(gè)質(zhì)子形成［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰，作為母離子。分別對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，以獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子。分別選擇離子豐度高、基線噪聲低的兩對(duì)離子對(duì)作為定性離子對(duì)，選擇其中離子豐度最高的離子對(duì)作定量離子對(duì)；在此基礎(chǔ)上逐個(gè)優(yōu)化了對(duì)靈敏度影響較大的碰撞能量和源內(nèi)碎裂電壓，使選定的子離子組成的特征離子的豐度和比例達(dá)到最佳。最后得到優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表2。

2.4 樣品前處理與基質(zhì)效應(yīng)的考察

為了使測(cè)定的黃酮類物質(zhì)覆蓋面廣，前處理采用2 mol／L 的鹽酸水解，可將多種結(jié)合態(tài)的黃酮轉(zhuǎn)化成黃酮苷元后測(cè)定。采用處理后加標(biāo)法考察了基質(zhì)效應(yīng)［14，15］，以加標(biāo)后測(cè)出濃度對(duì)應(yīng)加入濃度計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基質(zhì)對(duì)部分黃酮成分有一定的抑制效應(yīng)，但基質(zhì)抑制效應(yīng)均＜10%，可能是由于各物質(zhì)達(dá)到充分分離以及樣品是稀釋了250 倍之后檢測(cè)，所以基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)定量影響不大，因此本方法可以不考慮基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量的影響。

2.5 線性范圍、檢出限和定量限

將上述質(zhì)量濃度為10、5、1、0.5、0.1、0.025、0.01、0.001 mg／L 的16 種混合對(duì)照品溶液分別在最優(yōu)條件下測(cè)定，得出16 種物質(zhì)濃度與峰面積的關(guān)系，以S／N＝3 確定方法的檢出限，以S／N ＝10 確定方法的定量限，檢出限、定量限及線性回歸方程等參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 16 種黃酮類化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear regression equations，linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of the 16 flavonoids

2.6 回收率、精密度和穩(wěn)定性

取約0.11 g 到0.12 g 的銀杏保健茶樣品（批號(hào)：130411），精密稱定，水解前分別添加1、10、50 mg／L 3 種水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，每個(gè)濃度平行做6個(gè)樣品，按1.3 節(jié)方法處理，分別進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)，取6 次測(cè)定的平均值，16 種黃酮成分在3 種不同添加濃度下的回收率都在70.9% ～100.0%之間，RSD＜10%（見(jiàn)表4）。取對(duì)照品溶液在一日內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)（共6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，間隔控制在4 h）測(cè)定和在不同日期（3 天內(nèi)的同一時(shí)間）測(cè)定，除了兒茶素只在12 h 內(nèi)穩(wěn)定以外，其他黃酮類成分的日內(nèi)RSD 均小于5.0%，日間RSD 均小于10%；另取水解后的樣品溶液在一日內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)（共6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，間隔控制在4 h）測(cè)定，16 種黃酮類成分的RSD 值均小于10%，滿足定量分析要求。

2.7 產(chǎn)品的質(zhì)量控制

采用該方法檢測(cè)了6 批保健茶產(chǎn)品銀杏保健茶（批 號(hào)：130411、130421、130425、130429、130502、130513），檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。結(jié)果顯示6 批銀杏保健茶的16 種黃酮類成分的總含量均在0.8%左右，山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荊素、木犀草素、兒茶素、芹菜素、柚皮素、異鼠李素9 種主要成分均占16 種黃酮成分的99.5%以上，說(shuō)明該6 批銀杏保健茶質(zhì)量?jī)?yōu)良、穩(wěn)定性好。

表4 16 種黃酮成分的加標(biāo)回收率及RSD （n＝6）Table 4 Recoveries and RSDs of the 16 flavonoids （n＝6）

表5 6 批樣品的16 種黃酮成分的含量Table 5 Contents of the 16 flavonoids in six batches of samples

3 結(jié)論

本文建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定銀杏保健茶中兒茶素、牡荊素、葛根素、大豆苷元、水飛薊賓、槲皮素、木犀草素、芹菜素、柚皮素、橙皮素二氫查爾酮、山柰酚、橙皮素、異鼠李素、黃芩素、川陳皮素、桔皮素等16 種黃酮類物質(zhì)。本法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可用來(lái)控制銀杏保健茶的質(zhì)量。最終選擇含量較高的山柰酚、槲皮素、橙皮素、牡荊素、木犀草素、兒茶素、芹菜素、柚皮素、異鼠李素9 種成分作為質(zhì)控指標(biāo)，建立銀杏保健茶的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，符合現(xiàn)代中藥復(fù)方多成分、多指標(biāo)質(zhì)量控制的理念。

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