宋寧寧， 張科明 ， 劉向紅， 桑 彤， 孫 煜， 滕南雁

（廣西食品藥品檢驗所，廣西 南寧530021）

涼茶是嶺南人民根據(jù)本地的氣候和水土特性，在長期預(yù)防疾病與保健過程中以中醫(yī)養(yǎng)生理論為指導(dǎo)，以中草藥為基礎(chǔ)，研制總結(jié)出來的具有清熱解毒、生津止渴等功效的一類植物飲料［1-3］，深受粵桂港各界人士喜愛，歷久不衰。近年來，不法分子由于利益驅(qū)使，向涼茶中非法添加化學(xué)藥物以提高其功效。涼茶是食品，不能宣稱療效，不能添加化學(xué)藥物，如其中違法添加了化學(xué)藥物，在涼茶飲用無量的限制情況下，飲用不當(dāng)將導(dǎo)致多種不良反應(yīng)和并發(fā)癥，甚至危及生命［4，5］。國家對自制出售的涼茶尚未出臺強制性標(biāo)準(zhǔn)，衛(wèi)生及食品藥品監(jiān)管部門對涼茶的監(jiān)管尚屬空白。因此建立一種簡便、靈敏、快捷的方法檢查產(chǎn)品中是否非法添加化學(xué)藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

目前，非法添加化學(xué)藥物的研究主要集中在保健食品和中成藥上，采用的方法包括薄層色譜法［6，7］、高效液相色譜法［8，9］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-13］，其前處理方法均比較簡單。涼茶中含有大量的親水性多糖、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)以及葉綠素，成分復(fù)雜，因此其非法添加化學(xué)藥物的分析難度較保健食品、中成藥大。

QuEChERS 方法快速、簡便、成本低廉、易于操作，已逐步被應(yīng)用于多類農(nóng)藥、獸藥殘留檢測［14-18］。本實驗采用改進的QuEChERS 方法提取、凈化樣品，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測，建立了涼茶中非法添加的12 種化學(xué)藥物的同時快速檢測方法，為涼茶的日常監(jiān)督提供了科學(xué)、客觀的技術(shù)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX Qtrap 4500 線性離子阱質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）（美國Applied Biosystems 公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品包括磺胺甲惡唑、富馬酸酮替芬、馬來酸氯苯那敏、氫化可的松、鹽酸苯海拉明、吡羅昔康、鹽酸賽庚啶、苯甲酸甲硝唑、美洛昔康、萘普生、α-細(xì)辛腦均購自中國生物制品檢定研究院，潑尼松醋酸酯購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司，純度均不低于99%；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純，購自美國Fisher 公司；氯化鈉、無水硫酸鎂為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。吸附劑C18、PSA（硅膠表面鍵合-N-丙基乙二胺）、GCB（石墨化炭黑）購自上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

實驗樣品購于南寧、梧州、玉林、北海等地市場，包括感冒茶、止咳茶、清熱降火茶、祛風(fēng)除濕茶、喉痛茶等共74 個品種。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg 分別置于25 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為400 mg／L 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，在-18 ℃儲存。使用時根據(jù)需要吸取適量的各化合物標(biāo)準(zhǔn)儲備液混合，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18 ℃下儲存。

1.3 樣品處理

準(zhǔn)確移取樣品5.00 mL（精確至0.01 mL）于15 mL 聚丙烯塑料離心管中，加入5.00 mL 乙腈，振蕩1 min 后加入0.5 g 無水MgSO4和2.0 g NaCl，渦旋混勻后振蕩5 min，于6 000 r／min 離心5 min，收集上清液于另一15 mL 離心管（已加入35 mg PSA、65 mg C18 和250 mg 無水MgSO4）中，渦旋2 min，于6 000 r／min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 有機濾膜，濾液供LC-MS／MS 測定。

1.4 色譜條件

色譜柱：XBridge BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%（v／v）乙酸水溶液；梯度洗脫程序：0 ～4 min，15%A～30%A；4 ～7 min，30% A；7 ～13 min，30% A ～50%A；13 ～16 min，50%A；16 ～17 min，50%A ～90%A；17 ～20 min，90%A；20 ～21 min，90%A ～15%A；21～24 min，15%A。流速：0.5 mL／min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子（ESI）源；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；噴霧電壓（IS）：5 500 V；離子源溫度（TEM）：650 ℃；氣簾氣（CUR）流速：35 L／min；霧化氣（GS1）流速：55 L／min；輔助加熱氣（GS2）流速：55 L／min；射入電壓（EP）：10 V；碰撞室射出電壓（CXP）：13 V；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件

在電噴霧正離子模式下分別對1 mg／L 的單個標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描，得到每種化合物的分子離子，然后對分子離子進行子離子掃描，選擇信號強度較大的兩個碎片離子為特征子離子，其中相對豐度最強的為定量離子，其次為定性離子，并優(yōu)化得到每個化合物的母離子和子離子所需的最佳去簇電壓和碰撞能量，最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進行掃描。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 12 種化學(xué)藥物的保留時間、質(zhì)譜檢測參數(shù)、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限和定量限Table 1 Retention times，mass spectrometric parameters，linear ranges，linear equations，correlation coefficients （r），LODs and LOQs for the 12 chemical drugs

2.1.2 色譜條件

本研究考察了ODS-3（100 mm×2.1 mm，2.1 μm）、Cortecs C18＋（100 mm×4.6 mm，2.7 μm）以及XBridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）3種型號的色譜柱對12 種化學(xué)藥物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ODS-3 柱分離得到的色譜峰大部分存在峰前伸、分離度差的現(xiàn)象；Cortecs C18＋存在美洛昔康、吡羅昔康色譜峰拖尾的情況；XBridge BEH C18 柱分離得到的色譜峰響應(yīng)相對較高，且分離度良好。故本實驗選擇XBridge BEH C18 柱進行分離。

實驗中考察了水-乙腈、0.1% （v／v）甲酸水溶液-乙腈、0.1%（v／v）乙酸水溶液-乙腈、0.02 mol／L乙酸銨溶液-乙腈、0.1% （v／v）乙酸水溶液-0.1%（v／v）乙酸乙腈、0.1%（v／v）甲酸溶液-甲醇和0.02 mol／L 乙酸銨溶液（含0.1%（v／v）乙酸）-乙腈等流動相體系對12 種化學(xué)藥物的色譜峰形、分離度以及信號強度的影響。通過比較發(fā)現(xiàn)，含有0.02 mol／L乙酸銨溶液系統(tǒng)的流動相均抑制萘普生、磺胺甲惡唑、吡羅昔康、美洛昔康以及馬來酸氯苯那敏等化合物的電離，大部分化合物的色譜峰均出現(xiàn)不同程度的拖尾及分叉現(xiàn)象；含有甲醇體系的流動相會使大部分化合物色譜峰拖尾、峰形鈍化；含有甲酸體系的流動相抑制萘普生的電離致使其不出現(xiàn)色譜信號；0.1%（v／v）乙酸水溶液-乙腈作為流動相，12 種化學(xué)藥物的分離效果好、信號強度相對更高。故本實驗選擇0.1%（v／v）乙酸水溶液-乙腈作為流動相。

梯度洗脫條件的優(yōu)化：經(jīng)過反復(fù)試驗，改變不同時間段流動相中有機相和水相的比例，最終確定了最佳梯度洗脫條件，獲得了12 種化學(xué)藥物的最佳分離效果。12 種化學(xué)藥物的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 12 種化學(xué)藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mg／L）的LC-MS／MS 色譜圖Fig.1 LC-MS／MS chromatogram of a mixed standard solution of the 12 chemical drugs （0.05 mg／L）

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇

丙酮、乙酸乙酯和乙腈是藥物殘留分析常用的提取劑。涼茶一般為一種或多種中草藥的水溶液提取物，其中含有大量親水性成分，如無機鹽、糖類、中等分子的多糖類、鞣質(zhì)、氨基酸、蛋白質(zhì)、有機酸鹽、生物堿鹽及苷類等，基質(zhì)復(fù)雜。與丙酮和乙酸乙酯相比，乙腈的通用性更強，不易提取色素和基質(zhì)中的鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分，故本實驗選用乙腈作提取劑。

2.2.2 吸附劑的種類和用量

QuEChERS 方法中，PSA、C18 和GCB 是常見的3 種吸附劑。最常用的PSA 去除脂肪酸效果較好，但去除色素、甾醇和維生素能力一般；C18 可以去除部分色素、甾醇和維生素，但對非極性化合物有較強的吸附；GCB 去除色素、維生素和甾醇的能力較好，但對極性化合物的吸附作用較強，特別是對含有芳香環(huán)及對稱性結(jié)構(gòu)的化合物。本實驗考察了PSA-GCB 的組合，隨著GCB 的加入，大部分化合物均無信號。繼而考察PSA-C18 的組合，當(dāng)PSA 與C18 的質(zhì)量比為35 ∶65 時，12 種化學(xué)藥物的回收率均能達到60% 以上（見圖2）。因此選擇PSA-C18（35 ∶65，m／m）的吸附劑組合。

圖2 吸附劑比例對12 種化學(xué)藥物回收率的影響Fig.2 Effect of sorbent ratio on the recoveries of the 12 chemical drugs

2.2.3 除水劑的用量

圖3 除水劑組成比例對12 種化學(xué)藥物回收率的影響Fig.3 Effect of water remover ratio on the recoveries of the 12 chemical drugs

QuEChERS 方法中，采用飽和鹽析方法有利于有機相與水相的分層，減少共提取物質(zhì)，增加目標(biāo)物的回收率。為了促使兩相快速分層，需要加入過飽和的無水MgSO4。實驗初步固定MgSO4用量（1.6 g）后對NaCl 的用量進行優(yōu)化［19］，得到NaCl 最佳使用量后再對無水MgSO4的用量進行優(yōu)化。當(dāng)無水MgSO4和NaCl 的質(zhì)量分別為0.5 g 和2.0 g 時，兼顧了所有目標(biāo)化合物的回收率，因此該組合為最佳組合（見圖3）。

2.2.4 方法的線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率和精密度

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用甲醇配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進樣進行測定，以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)見表1?？梢?2 種化學(xué)藥物在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，定量離子的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.997 8～1.000 0。

在陰性涼茶樣品中添加不同濃度的待測物，按本研究建立的方法進行檢測，以S／N ＝10 計算方法的定量限，12 種化學(xué)藥物的定量限在0.4 ～8.0 μg／L 之間；以S／N ＝3 計算方法的檢出限，12 種化學(xué)藥物的檢出限在0.1～2.1 μg／L 之間。

在陰性涼茶樣品中分別添加3 個水平的12 種待測化合物，每個水平平行測定6 份樣品，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見表2?？梢钥闯?，12 種化合物在3 個加標(biāo)水平下的平均回收率在62.7% ～95.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1.3%～10.8%之間。

表2 陰性涼茶樣品中12 種化學(xué)藥物的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations （RSDs）of the 12 chemical drugs spiked in a blank sample （n＝6）

2.3 實際樣品的測定

采用本研究建立的檢測方法對從南寧、梧州、玉林、北海等地市場購買的74 份涼茶樣品進行測定。檢測結(jié)果顯示，從降火、止咳、喉痛、感冒茶各1 批中檢出吡羅昔康，檢出量分別為7.2、8.8、23、17 μg／L；感冒、止咳茶各1 批中檢出磺胺甲惡唑，檢出量分別為162、105 μg／L；感冒、喉癥茶各1 批中檢出馬來酸氯苯那敏，檢出量分別為724、1 053 μg／L；1 批五花祛濕茶檢出氫化可的松，檢出量為45 μg／L。其余樣品均未檢出上述化學(xué)藥物。

3 結(jié)論

本文將QuEChERS 前處理方法應(yīng)用于涼茶中非法添加化學(xué)藥物的檢測，通過對QuEChERS 前處理方法及儀器色譜條件的優(yōu)化，建立了定性、定量測定涼茶中12 種非法添加的化學(xué)藥物的檢測方法。該方法操作簡便、靈敏度高，對涼茶基質(zhì)凈化效果好，可用于涼茶中多種非法添加化學(xué)藥物的快速篩查和確證。

實驗結(jié)果顯示，除馬來酸氯苯那敏外，其他幾類藥物的添加量均較低。盡管如此，非法添加化學(xué)藥物對涼茶飲用者身體健康影響的風(fēng)險依然存在。涼茶是兩廣地區(qū)民眾喜愛的飲品，民間使用歷史悠久，一年四季皆可飲用，尤其是在酷熱的盛夏，涼茶更是人們解暑去熱的必備之物。然而部分涼茶中非法添加的化學(xué)藥物，在長期飲用涼茶的情況下就會給身體帶來危害。

涼茶的小作坊遍布兩廣城鄉(xiāng)各處的路邊攤點，還存在流動攤販。小作坊目前仍是食品供應(yīng)的重要組成部分。小作坊操作人員普遍存在食品質(zhì)量安全知識缺乏、質(zhì)量衛(wèi)生控制能力薄弱等問題，從而常常導(dǎo)致食品安全事故發(fā)生。因此建議將涼茶的小作坊列入食品質(zhì)量安全監(jiān)管的范疇，促進其不斷規(guī)范和提高，這對從根本上保證涼茶的質(zhì)量安全，提高整體食品質(zhì)量安全水平都有著十分重要的意義。

［1］ Deng J W，F(xiàn)an C L，Yang Y Y. J Pharm Biomed Anal，2011，56：928

［2］ Wang P，Xiao G S，Zhang Y S，et al. Food Science and Technology （王萍，肖更生，張友勝，等. 食品科技），2010，35（2）：77

［3］ Yang Y Y，Deng J W，Wu Q H，et al. Journal of Instrumental Analysis （楊運云，鄧潔薇，吳慶暉，等. 分析測試學(xué)報），2012，31（12）：1493

［4］ Liu F Y，Li J，Xie Y C，et al. Chinese Pharmaceutical Affairs（劉福艷，李軍，謝元超，等. 中國藥事），2008，22（12）：1067

［5］ Dong Y C，Du S M，Chen Y S，et al. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research （董永成，杜士明，陳永順，等. 時珍國醫(yī)國藥），2006，17（8）：1601

［6］ Zhu Q X，Cao Y B，Cao Y Y，et al. Spectroscopy and Spectral Analysis （朱青霞，曹永兵，曹穎瑛，等. 光譜學(xué)與光譜分析），2014，34（4）：990

［7］ Su J. Yunnan Journal of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica （蘇健. 云南中醫(yī)中藥雜志），2014，35（4）：64

［8］ Zhang Y H，Dong H M. Shandong Chemical Industry （張月輝，董慧明. 山東化工），2015，44（4）：69

［9］ Pei Y M. Chinese Traditional and Herbal Drugs （裴月梅. 中草藥），2014，45（23）：3414.

［10］ Li Y J，Ou G D，Li Y X，et al. Chinese Traditional Patent Medicine （李楊杰，歐國燈，李泳雪，等. 中成藥），2013，35（5）：956

［11］ Zhu F，Ruan L P，Ma Y J，et al. Chinese Journal of Chromatography （朱峰，阮麗萍，馬永健，等. 色譜），2014，32（1）：13

［12］ Lu L，Gong X，Tan L. Chinese Journal of Chromatography（蘆麗，宮旭，譚力. 色譜），2015，33（3）：256

［13］ Zhang S，Hu Q，Sun J，et al. Chinese Traditional Patent Medicine （張甦，胡青，孫健，等. 中成藥），2015，37（3）：542

［14］ Lopes R P，Reyes R C，Romero-Gonzalez R，et al. J Chromatogr B，2012，895／896：39

［15］ Stubbings G，Bigwood T. Anal Chim Acta，2009，637（1／2）：68

［16］ Qu B. Chinese Journal of Food Science （曲斌. 食品科學(xué)），2013，34（5）：327

［17］ Yi J H，Duan Z J，F(xiàn)ang G Z，et al. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology （易江華，段振娟，方國臻，等. 中國食品學(xué)報），2013，13（2）：153

［18］ Wang W，Shi Z H，Kang J，et al. Journal of Instrumental Analysis （王偉，石志紅，康健，等. 分析測試學(xué)報），2013，32（4）：82

［19］ Zhang Y H，Jiao B N，Zhou Z Q. Chinese Journal of Analytical Chemistry （張耀海，焦必寧，周志欽. 分析化學(xué)），2012，40（10）：1536