殷 耀 ， 陳恵蘭， 陳 磊， 別小妹， 丁 濤，張曉燕， 吳 斌， 沈崇鈺， 張 睿

（1. 江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇 南京210001；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京210014）

馬桑（Coriaria sinica）是馬桑科馬桑屬植物，為多年生落葉小喬木或灌木，原產(chǎn)于新西蘭，在我國(guó)也有廣泛分布［1］。馬桑果實(shí)有劇毒，羥基馬桑毒素（tutin）是其主要毒性成分，屬于二環(huán)倍半萜內(nèi)酯類毒素，毒理與印防己毒素相似，且更為強(qiáng)烈，它通過(guò)刺激大腦皮層引起興奮、痙攣、嘔吐等一系列中毒癥狀，頻繁的強(qiáng)直抽搐可致腦水腫、呼吸衰竭等，其他如肺、肝、心、腎等臟器亦受損害［2-4］。

馬桑內(nèi)酯主要為馬桑毒素、馬桑亭、羥基馬桑毒素、馬桑寧、雙氫馬桑毒素、阿樸馬桑毒素、羥基馬桑亭［5-9］。

馬桑屬植物是在新西蘭廣泛分布的一種有毒原生植物物種，若蜜蜂采集到澳洲廣翅蠟蟬排到馬桑葉子上的含有很多植物糖及羥基馬桑毒素的未消化的汁液的蜜露，則蜂巢里的蜂蜜和分離出的蜂蜜均可能是有毒的，這增加了人們食用高濃度羥基馬桑毒素蜂蜜的概率［10］。澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局（FSANZ）于2014 年11 月4 日發(fā)布標(biāo)準(zhǔn)通知公告23-14，提出了羥基馬桑內(nèi)酯在所有蜂蜜中的最大殘留限量為0.7 mg／kg［11，12］。

目前，馬桑毒素的研究集中在神經(jīng)系統(tǒng)藥理活性以及殺蟲(chóng)活性方面，被認(rèn)為是昆蟲(chóng)行為的干擾劑、拒食劑和胃毒劑［13］。在含量測(cè)定方面，澳大利亞AsureQuality 公司使用液液萃取后過(guò)固相萃取小柱的前處理方法對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行處理，通過(guò)配有大氣壓化學(xué)電離源（APCI）的高效液相色譜-質(zhì)譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分析［14］。此方法前處理較為繁瑣，并且使用了丙酮、二氯甲烷等毒性較高的有機(jī)試劑。

本文采用磷酸鹽緩沖溶液提取蜂蜜中的馬桑毒素，經(jīng)固相萃取小柱凈化，最后由高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單快捷，回收率穩(wěn)定，能滿足日常檢測(cè)需要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Q Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜及DIONEX UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（Thermo Fisher 公司，美國(guó)）；氮吹儀（Organomation 公司，美國(guó)）；Preval SPE 304＋全自動(dòng)固相萃取裝置（普立泰科公司，中國(guó)）；Option-Q 超純水儀（Elga 公司，美國(guó)）。

甲醇（色譜純，Merck 公司），磷酸二氫鉀和氫氧化鈉（分析純，南京化學(xué)試劑廠）。3 種馬桑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（羥基馬桑毒素、馬桑亭（coriatin）、馬桑寧（corianin））的純度均大于96% （云南西力生物技術(shù)公司）；蜂蜜為新西蘭進(jìn)口的麥盧卡蜂蜜。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取馬桑亭、馬桑寧、羥基馬桑毒素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL 容量瓶中，以甲醇定容，配制成1.0 g／L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于冷凍條件下保存。試驗(yàn)中根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取

稱取1.0 g 樣品于50 mL 玻璃離心管中，加入15 mL 0.2 mol／L 磷酸緩沖溶液（pH＝7.5），充分渦旋使蜂蜜樣品完全溶解，過(guò)濾。

1.3.2 凈化

將濾液全部過(guò)（3 mL，60 mg）HLB 小柱（活化：3 mL 甲醇、3 mL 水），上樣完畢后，用3 mL 水淋洗，再用5 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液至10 mL 玻璃試管，40 ℃下氮?dú)獯蹈?。加?.0 mL 甲醇-水溶液（30 ∶70，v／v）溶解殘?jiān)?，過(guò)有機(jī)相濾膜（0.22 μm），待用。

1.3.3 UPLC 條件

流動(dòng)相A 為超純水，B 為甲醇。洗脫梯度程序：0 ～2 min，10% B；2 ～5 min，10% B ～90% B；5～7.5 min，90% B；7.5 ～7.8 min，90% B ～10%B；7.8 ～10.0 min，10% B。進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL／min；柱溫：30 ℃；Phenomenex C18 100A色譜柱（100 mm×4.6 mm，2.6 μm）。

1.3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)量分析器為Orbitrap；可加熱的電噴霧離子源（HESI II），源溫度為350 ℃；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；離子傳輸管溫度為300 ℃；鞘氣為50 unit，輔助氣為10 unit。t-MS2掃描模式：負(fù)離子模式采集；關(guān)聯(lián)Inclution list，分辨率70 000 FWHM；碰撞池能量（NCE）為35 eV。3 種馬桑毒素的UPLC-Q Exactive MS 分析參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 3 種馬桑內(nèi)酯的UPLC-Q Exactive MS 分析參數(shù)Table 1 UPLC-Q Exactive MS parameters of the three coriaria lactones

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取和凈化

蜂蜜樣品含有大量糖類物質(zhì)，在含水溶液中溶解性較好，馬桑內(nèi)酯在中性pH 溶液中穩(wěn)定，本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取和凈化方法對(duì)馬桑內(nèi)酯類物質(zhì)的影響。A：水溶解蜂蜜樣品后，用0.1 mol／L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至中性，再用乙酸乙酯進(jìn)行液液萃取，結(jié)果顯示：液液萃取的凈化效果不夠充分，儀器檢測(cè)時(shí)干擾很大；B：分別用pH 6 ～7、pH 7 ～8、pH 8 ～9 的磷酸二氫鉀緩沖溶液（0.2 mol／L）提取蜂蜜樣品，經(jīng)反相固相萃取小柱C18 和HLB 凈化，結(jié)果顯示：用pH 在7 ～8 之間的磷酸二氫鉀緩沖溶液提取樣品，經(jīng)HLB 小柱凈化回收率最好。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇pH ＝7.5（±0.5）的磷酸二氫鉀緩沖溶液（0.2 mol／L）和HLB 小柱對(duì)樣品進(jìn)行提取和凈化。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用四極桿質(zhì)譜對(duì)3 種馬桑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行調(diào)諧，然后測(cè)定空白試劑，發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下空白試劑中存在信號(hào)響應(yīng)值很高、質(zhì)量數(shù)為293.1 的色譜峰（見(jiàn)圖1），經(jīng)高分辨質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)此干擾物質(zhì)精確質(zhì)量數(shù)為293.174 19，而羥基馬桑毒素和馬桑寧內(nèi)酯的精確質(zhì)量數(shù)為293.101 62，四極桿質(zhì)譜無(wú)法區(qū)分質(zhì)量數(shù)如此接近的物質(zhì)。

圖1 空白試劑的三重四極桿質(zhì)譜的色譜圖Fig.1 Chromatogram of triple quadrupole mass spectrometer for a blank solution

利用UPLC-Q Exactive 對(duì)3 種化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行負(fù)離子全掃描，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)信號(hào)響應(yīng)值較高的色譜峰的質(zhì)量數(shù)分別為293.174 19、293.101 62 和295.116 82（見(jiàn)圖2）。由于羥基馬桑毒素和馬桑寧內(nèi)酯為同分異構(gòu)體，理論質(zhì)量數(shù)為293.109 79，同時(shí)進(jìn)樣的空白試劑（超純水、甲醇和乙腈）譜圖中均發(fā)現(xiàn)293.174 19 的色譜峰存在，但293.101 62 不存在，因此確定293.174 19 為一種干擾物質(zhì)，目前尚未查明此物質(zhì)來(lái)源何處，在其他實(shí)驗(yàn)室也發(fā)現(xiàn)存在此物質(zhì)。

由于干擾物質(zhì)的存在，并且羥基馬桑毒素和馬桑寧內(nèi)酯為同分異構(gòu)體，為了能夠準(zhǔn)確地定性和定量分析，比較了不同流動(dòng)相組成對(duì)同分異構(gòu)體的分離程度、色譜峰形和質(zhì)譜信號(hào)的影響。結(jié)果表明，采用0.01% （v／v）甲酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，無(wú)論是色譜峰形還是質(zhì)譜的信號(hào)強(qiáng)度都不理想。采用0.03% （v／v）氨水溶液和甲醇作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫可以有更高的質(zhì)譜信號(hào)，但是干擾物質(zhì)的出峰時(shí)間會(huì)和羥基馬桑毒素出峰時(shí)間重疊，對(duì)羥基馬桑毒素的定性分析存在一定的干擾。采用水和甲醇作為流動(dòng)相，在最佳分離條件下進(jìn)行梯度洗脫，色譜峰形良好并且可以使干擾物質(zhì)、羥基馬桑毒素以及馬桑寧內(nèi)酯完全分開(kāi)，質(zhì)譜信號(hào)良好（見(jiàn)圖3）。

圖2 馬桑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-Q Exactive 色譜圖Fig.2 Chromatograms of UPLC-Q Exactive for coriaria lactone standards

最后利用t-MS2掃描模式，利用保留時(shí)間和母離子的精確質(zhì)量數(shù)以及1 個(gè)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性分析，采用豐度最高的碎片離子進(jìn)行定量分析。

圖3 水和甲醇梯度洗脫的馬桑內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.3 Chromatograms of coriaria lactone standards with a gradient elution using pure water and methanol

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線性范圍、檢出限和定量限

以空白基質(zhì)為稀釋液配制3 種馬桑內(nèi)酯的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05﹑0.1﹑0.2﹑0.5和1.0 mg／L）進(jìn)樣分析，以外標(biāo)法定量。以定量離子的峰面積（Y）作為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)質(zhì)量濃度（X，mg／L）作為橫坐標(biāo)，結(jié)果表明3 種馬桑內(nèi)酯在0.05 ～1.0 mg／L范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.99。在空白樣品中添加0.05、0.1 和0.2 mg／kg 共3 個(gè)水平的3 種馬桑內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按已建立的方法測(cè)定，按3 倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為檢出限，10倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為定量限，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3 種馬桑內(nèi)酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients （r2），linear ranges，LODs and LOQs of the three coriaria lactone

2.3.2 準(zhǔn)確度和精密度

以空白蜂蜜樣品加標(biāo)的回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。向空白蜂蜜樣品中添加3 種馬桑內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為0.1、0.2 和0.5 mg／kg，每個(gè)加標(biāo)水平樣品按照1.3.1 節(jié)方法處理，其回收率和RSD 見(jiàn)表3。3 種馬桑內(nèi)酯的平均回收率為86.3% ～95.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0% ～8.4%。空白加標(biāo)回收結(jié)果說(shuō)明方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 空白蜂蜜樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Table 3 Results of recovery test of the spiked blank honey samples （n＝6）

2.4 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本文所建立的方法對(duì)新西蘭進(jìn)口的52 批次麥盧卡蜂蜜進(jìn)行測(cè)定，檢出1 份樣品含羥基馬桑毒素0.3 mg／kg。

3 結(jié)論

采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)建立了蜂蜜中3 種馬桑內(nèi)酯殘留的檢測(cè)方法。本方法用固相萃取技術(shù)對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行了充分凈化，利用色譜分離機(jī)制把2 種同分異構(gòu)體完全分開(kāi)，通過(guò)高分辨質(zhì)譜的t-MS2掃描模式進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量檢測(cè)。經(jīng)實(shí)際樣品檢測(cè)的考察，該方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確，適合于蜂蜜中馬桑內(nèi)酯類化合物的日常檢測(cè)。

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