張俊杰， 趙春霞， 趙燕妮， 趙潔妤， 李麗麗， 路 鑫 ， 許國旺

（中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，遼寧 大連116023）

氨基化合物是植物中的一類重要化合物，廣義上包括氨基酸［1-3］、生物胺［4］（單胺、多胺、無機(jī)胺）、二肽及生物堿［4，5］等，它們參與植物氮代謝過程，在植物生長代謝中發(fā)揮著重要作用。如氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，一些氨基酸本身對植物代謝有調(diào)節(jié)作用［2，3］；多胺［4］、生物堿［4，5］等在植物應(yīng)激及抗逆等方面均發(fā)揮著重要作用。因此對植物中氨基化合物進(jìn)行分析具有十分重要的意義。打頂是烤煙大田生產(chǎn)中重要的農(nóng)藝措施，烤煙打頂?shù)闹饕饔檬窍敹藘?yōu)勢，平衡養(yǎng)分分配，控制植株縱向生長，避免出現(xiàn)無效蕾和枝葉，協(xié)調(diào)養(yǎng)分的運(yùn)轉(zhuǎn)方向，以保證收獲物有足夠的養(yǎng)分形成產(chǎn)量，并使內(nèi)部化合物向有利于提高煙葉品質(zhì)的方向轉(zhuǎn)化［6］。研究打頂對不同部位氨基化合物的影響，也有十分重要的意義，但鮮有采用代謝組學(xué)手段進(jìn)行研究的報道。

氨基化合物在反相液相色譜中難以保留，離子抑制嚴(yán)重，造成其定量分析困難［7-9］。衍生化方法是提高其離子化效率和反相色譜保留的比較常用的方法［7-9］，目前已有文獻(xiàn)報道了眾多衍生化試劑用于氨基酸及胺類化合物的分析檢測，包括鄰苯二甲醛［10］、乙氧基甲叉丙二酸二乙酯［11］、6-氨基喹啉-N-琥珀酰亞胺甲酯（AQC）［12-15］、苯甲酰氯［16］、7-氯-4-硝基苯惡二唑異硫氰酸苯酯［17］、4-羥基-3-甲氧基肉桂醛［18］、對甲氧基苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺［19］、丹磺酰氯［20-23］等。其中AQC 試劑可特異性衍生氨基化合物中含伯胺和仲胺基團(tuán)的代謝物，增強(qiáng)胺類物質(zhì)在反相色譜中的保留，提高離子化效率，從而達(dá)到更高的檢測靈敏度。目前的報道多側(cè)重于用AQC衍生某些生物樣品中的氨基酸或者胺類［12-15］，方法只限于對少數(shù)已知的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性定量分析，尚未有同時測定植物中多種類氨基化合物的報道，因此迫切需要發(fā)展一種高靈敏的同時分析植物樣品中盡可能多的氨基化合物代謝譜的分析方法。三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（QQQ MS）和四極桿-飛行時間高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF MS）是兩種常見的空間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。QQQ MS 靈敏度高，定量的精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，已被廣泛用于目標(biāo)化合物的定量分析；其母離子掃描和中性丟失掃描模式有很好的選擇性和靈敏度，特別適合在復(fù)雜樣品中高靈敏地篩選具有特征基團(tuán)的離子，但不足是質(zhì)量分辨率較低。Q-TOF MS 是高分辨質(zhì)譜，且可提供MS／MS 信息，常用于未知樣品的定性，但其定量能力弱于QQQ MS。

本文建立了一種基于柱前衍生-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的植物提取液中氨基化合物代謝譜分析方法。充分利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-QQQ MS）和超高效液相色譜-四極桿-飛行時間高分辨串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF MS）技術(shù)的優(yōu)勢，在樣品中未知氨基化合物的高選擇性發(fā)現(xiàn)及高分辨質(zhì)譜定性基礎(chǔ)上，實現(xiàn)高靈敏度檢測。將該方法用于植物提取液分析，可實現(xiàn)樣品中幾十種氨基化合物的定性和高靈敏度檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

液相色譜系統(tǒng)為Agilent 1290 超高效液相系統(tǒng)，四極桿飛行時間高分辨質(zhì)譜為Agilent 6540，三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)為Agilent 6460。高速離心機(jī)（中國天美公司）。

所用試劑包括：Waters AccQ-Tag derivation kit 衍生試劑盒（美國Waters 公司）、HPLC 級乙腈（德國默克公司）、甲酸、甲酸銨（美國Sigma-Aldrich 公司），水由Millipore 超純水系統(tǒng)制備。

氨基化合物標(biāo)準(zhǔn)品中乙醇胺（ethanolamine）、丙氨酸（L-alanine）、脯氨酸（L-proline）、苯乙胺（phenylethylamine）、亮氨酸（L-leucine）、谷氨酸（L-glutamic acid）、蛋氨酸（L-methionine）、組氨酸（histidine）、2-氨 基 己 二 酸（DL-2-aminoadipic acid）、苯丙氨酸（L-phenylalanine）、3-甲氧基酪胺（3-methoxytyramine）、色氨酸（DL-tryptophan）、異丁胺（isobutylamine）購自百靈威。甘氨酸（glycine）、乙酰腐胺（acetylputrescine）、異亮氨酸（Lisoleucine）、天 冬氨酸（L-aspartic acid）、酪 胺（tyramine）、奧克巴胺（octopamine）、丙氨酰丙氨酸（alanyl-alanine）、蛋氨酸亞砜（L-methionine sulfoxide）、精氨酸（L-arginine）、丙氨酰亮氨酸（alanyl-leucine）、鳥氨酸（ornithine）、高絲氨酸（Lhomoserine）、尿囊素（allantoin）、5-氨基戊酸（5-aminovaleric acid）、多巴胺（dopamine）、天冬酰胺（L-asparagine）、谷氨酰胺（L-glutamine）、絲氨酸（DL-serine）、β-丙氨酸（β-alanine）、賴氨酸（Llysine）、纈氨酸（L-valine）購自美國Sigma 公司，3-甲基丁胺（3-methylbutylamine）購自Dr. Ehrenstorfer GmbH；γ-氨基丁酸（GABA）、哌啶酸（Lpipecolic acid）、蘇氨酸（L-threonine）、羥基脯氨酸（OH-proline）、瓜氨酸（DL-citrulline）、酪氨酸（DLtyrosine）、乙胺（ethylamine）、丁胺（butylamine）購自Alfa-aesar 公司。內(nèi)標(biāo)氘代丙氨酸（alanine-d4）及正纈氨酸（norvaline）購自Sigma-Aldrich 公司。

1.2 植物樣品預(yù)處理

煙草鮮葉樣品由中國煙草研究院青州所提供，采下部葉、中部葉和上部葉，每個部位包括未打頂對照組和打頂實驗組，每個葉位均有5 ～6 個生物學(xué)重復(fù)，總計33 個樣品。新鮮采摘的葉片在液氮中冷凍研磨，低溫凍干，-80 ℃保存，準(zhǔn)確稱取10 mg 植物葉片粉末，加入1 mL 70% （v／v）C2H5OH （含內(nèi)標(biāo)正纈氨酸5 μg／mL、氘代丙氨酸2.5 μg／mL），渦旋提取10 min，15 000 r／m 離心10 min，上清液用Waters AccQ-Tag derivation kit 衍生，進(jìn)樣分析。

AQC 衍生的具體步驟為：70 μL pH 8.8 的硼酸鹽緩沖液中加入10 μL 樣品或者氨基化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋5 ～10 s，混勻后加入20 μL 衍生試劑，渦旋5 ～10 s，混勻后室溫下放置1 min 左右，于55℃加熱10 min。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱采用Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（Rapid Resolution HT 100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Agilent，USA）。流動相A：0.1% （v／v）甲酸水溶液（含5 mmol／L 甲酸銨）；流動相B：乙腈。流速：0.25 mL／min；柱溫：50 ℃。進(jìn)樣體積：定性時1 μL；UHPLC-QQQ MS 方法的進(jìn)樣體積為0.2 μL。液相色譜進(jìn)樣器溫度：4 ℃。定性步驟洗脫梯度為：0 ～1 min 保持5% B 的初始流動相，20 min 時線性上升至25% B，30 min 時線性上升至99% B，30.1 min 恢復(fù)到初始流動相5% B 并保持到35 min。UHPLC-QQQ MRM MS 方法的洗脫梯度為：0 ～1 min 保持5% B 初始流動相，20 min 時線性上升至25% B，25 min 時線性上升至57% B，25.1 min 時上升至99% B 并維持99% B 到27 min；27.1 min恢復(fù)到初始5% B 并保持到30 min。

圖1 基于AQC 衍生-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的植物提取液中氨基化合物代謝譜分析流程Fig.1 Flow chart of metabolic profiling analysis of amino metabolites in plant extract based on AQC derivatization-UHPLC MS

Agilent 6460 三重四極桿質(zhì)譜條件：ESI 正離子模式；離子源氣體溫度：300 ℃；氣體流速：8 L／min；霧化氣壓力：275.8 kPa；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：8 L／min；毛細(xì)管電壓：4 000 V；噴嘴電壓：600 V。母離子掃描增益電壓設(shè)置為400 EMV，MRM 掃描的子離子均為m／z 171，碰撞電壓、碰撞能參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化得到。

Agilent 6540 四極桿飛行時間質(zhì)譜條件：ESI 正離子模式；離子源氣體溫度：300 ℃；干燥氣體流速：10 L／min；霧化氣壓力：275.8 kPa；毛細(xì)管電壓：3 500 V；碰撞電壓：130 V；透鏡電壓：65 V。MS／MS掃描設(shè)置10、20、40 V 3 個不同碰撞能，母離子選擇時間窗口為1 min，母離子質(zhì)量數(shù)窗口選1 Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 AQC 柱前衍生-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法的建立

圖2 AQC 衍生的氨基化合物的發(fā)現(xiàn)和定性Fig.2 Discovery and identification of AQC derivatized amino metabolites

為實現(xiàn)未知樣品中盡可多的氨基化合物的高靈敏度代謝譜分析，在方法建立過程中采用UHPLCQQQ MS 和UHPLC-Q-TOF MS 兩種質(zhì)譜技術(shù)。方法建立的具體流程如圖1 所示，主要包括植物提取液衍生化、氨基化合物衍生產(chǎn)物的高選擇性發(fā)現(xiàn)、高分辨質(zhì)譜定性和高靈敏度代謝譜檢測幾個步驟。首先，植物提取液經(jīng)AQC 衍生，氨基化合物所含氨基的活潑氫被衍生基團(tuán)取代（見圖2a），生成含有特征官能團(tuán)的衍生產(chǎn)物。衍生產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜源內(nèi)誘導(dǎo)裂解（CID），產(chǎn)生特征子離子C10N2OH＋7（m／z 171）；以171 作為固定子離子，對衍生產(chǎn)物進(jìn)行UHPLCQQQ MS 母離子掃描，以1 Da 為單位進(jìn)行步進(jìn)式母離子提取，就可高靈敏度地篩選到具有特征衍生基團(tuán)（m／z 171）的離子，即得到全部衍生產(chǎn)物的母離子以及相應(yīng)的UHPLC 保留時間。但僅靠QQQ MS得到母離子質(zhì)量數(shù)（質(zhì)量精度1 Da），還無法對衍生產(chǎn)物進(jìn)行定性。為了進(jìn)一步得到定性信息，下一步需要在相同的UHPLC 條件下對衍生產(chǎn)物進(jìn)行UHPLC-Q-TOF MS 高分辨質(zhì)譜全掃描（分辨率40 000）和MS／MS 掃描，得到相應(yīng)保留時間衍生產(chǎn)物的精確質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜信息，以精確質(zhì)量數(shù)［M］＋-171.055 8 在10 ppm（10×10-6）范圍內(nèi)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫搜索，鎖定候選化合物，進(jìn)一步通過二級質(zhì)譜比對及標(biāo)樣驗證，對衍生產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確定性。最后，對所發(fā)現(xiàn)的全部衍生化的氨基化合物建立UHPLCQQQ MRM MS 高靈敏度檢測方法，通過標(biāo)樣或動態(tài)MRM 方法進(jìn)行MRM 參數(shù)優(yōu)化，最終實現(xiàn)代謝譜的高靈敏度定量分析。圖2 以新煙草堿（anatabine）為例，說明氨基化合物的篩選和定性過程。圖2b 是衍生化后植物提取液UHPLC-QQQ MS 母離子的總離子流圖（TIC），在保留時間8.6 min 檢測到m／z 331.0 的母離子。采用相同的UHPLC 條件進(jìn)行UHPLC-Q-TOF MS 分析，對應(yīng)保留時間8.6 min，提取離子流圖（EIC）得到該離子的精確質(zhì)量數(shù)為m／z 331.156 0（見圖2c），進(jìn)一步對該離子進(jìn)行MS／MS 分析得到二級質(zhì)譜信息（見圖2d），通過搜庫和標(biāo)樣驗證確認(rèn)該離子為新煙草堿的衍生產(chǎn)物。

以煙草鮮葉提取液為例，對其中的氨基化合物進(jìn)行分析。使用所建立的方法共檢測到了煙草鮮葉樣品中的87 種衍生化氨基化合物，包括氨基酸、胺、二肽及生物堿等物質(zhì)。其中43 種氨基化合物經(jīng)標(biāo)樣驗證，根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和文獻(xiàn)報道初步定性了6種代謝物，包括氨［24］、二甲胺［24］、甲胺［24］、新煙草靈Ⅰ［25］、新煙草靈Ⅱ［25］及假氧尼古?。?6］；根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和二級質(zhì)譜信息對4 種代謝物進(jìn)行了初步定性，包括降煙堿、新煙草堿Ⅰ、假木賊堿及新煙草堿Ⅱ；此外，通過精確質(zhì)量數(shù)搜庫初步定性出19 種代謝物，15 種衍生產(chǎn)物未知。對43 種經(jīng)標(biāo)樣驗證的氨基化合物標(biāo)準(zhǔn)品的MRM 掃描的碰撞能、碰撞電壓等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，最終得到離子對掃描的最佳質(zhì)譜條件（見表1）。在該條件下，所有氨基化合物的動態(tài)MRM 掃描色譜圖見圖3。

2.2 方法表征

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圖4 UHPLC-QQQ MRM MS 方法分析AQC 衍生的氨基代謝物的重復(fù)性Fig.4 Repeatability of AQC derivatized amino metabolites by UHPLC-QQQ MRM MS

采用6 個平行制備的煙草樣品考察所建立方法的重復(fù)性（見圖4），除煙葉中低含量的丁胺及一個未知氨基化合物（m／z 329）外，85 個氨基化合物的相對定量RSD 均小于20%（1.5% ～18.8% 間）。采用43種代謝物對方法進(jìn)行表征，結(jié)果見表1。方法的線性關(guān)系由標(biāo)準(zhǔn)樣品混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋至0.006 25、0.05、0.5、5、50 μg／mL 得到，線性范圍可達(dá)到4 個數(shù)量級。LOQ、LOD 分別對應(yīng)信噪比為10、3 時的質(zhì)量濃度，方法的LOQ 為0.09 ～21.93 ng／mL，LOD 可達(dá)到0.03 ～6.58 ng／mL。日內(nèi)精密度（RSD）為0.7% ～15.6%；日間精密度，除精氨酸外均小于20%（0.8% ～22.9% ）。對相當(dāng)于實際樣品濃度50%、80%、100% 的3 個水平的加標(biāo)樣品進(jìn)行分析，得到43 種物質(zhì)的低、中、高水平加標(biāo)回收率分別為74.8% ～122.7%、74.4% ～121.5%、76.3% ～119.5%。

2.3 方法應(yīng)用

取成熟的煙草鮮葉上部葉、中部葉和下部葉樣品33 個，分成打頂和不打頂對照兩組，將所建立的代謝譜方法用于研究打頂對不同葉位煙草鮮葉中氨基化合物的影響。圖5 是成熟期不同部位煙草鮮葉打頂前后氨基化合物主成分分析（PCA）的得分圖，明顯看出上部葉的打頂與未打頂兩組樣品有明顯分離趨勢，打頂對中部葉、下部葉影響不大，在PCA 上基本無分離趨勢。采用非參數(shù)檢驗也表明打頂與未打頂兩組有顯著性差異氨基化合物在上部葉中最多（見表2），中部葉中色氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、新煙草靈、假氧尼古丁、異丁胺、苯乙胺在兩組間有顯著差異，下部葉中僅天冬酰胺、甲胺、尿囊素在兩組間有顯著性差異。

圖5 不同部位成熟期煙葉PCA 得分圖Fig.5 PCA score plot of mature tobacco leaves on different leaf positions

表2 上部鮮煙葉打頂組與不打頂對照組有顯著性差異的氨基化合物Table 2 Significant changes of amino metabolites between the topping and the control groups of tobacco upper leaves

進(jìn)一步考察了打頂對上部葉代謝的影響，圖6是煙草中主要氨基化合物的代謝通路圖，圖中加方框的為本方法可檢測到的代謝物，檢測到的代謝物覆蓋了煙堿合成及其上游代謝、多酚合成上游代謝、生長素合成上游代謝等過程。從兩組中有顯著差異化合物（p＜0.05）和極顯著差異化合物（p＜0.01）可以看出，打頂后上部葉片參與生物堿合成的氨基化合物包括初級氨基酸谷氨酸和天冬氨酸，顯著上調(diào)。莽草酸代謝路徑酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸均顯著下調(diào)，可以推測，打頂后氨基化合物流向為從初級氨基酸到煙堿。煙堿自精氨酸或鳥氨酸途徑形成吡咯烷環(huán)，自天冬氨酸途徑形成吡啶環(huán)，最終兩環(huán)縮合形成煙堿，因此與生物堿合成相關(guān)的初級氨基酸代謝上調(diào)，表明煙草植株體內(nèi)氨基化合物對于打頂?shù)恼w反應(yīng)和代謝物協(xié)調(diào)性升降變化。打頂后氨基化合物到生物堿通路發(fā)生上調(diào)，而到生長素通路發(fā)生下調(diào)，已有文獻(xiàn)［27］對不同時期打頂后煙葉中淀粉、可溶性糖、總蛋白質(zhì)、煙堿含量進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)打頂對下部葉影響明顯小于中上部葉片。另外，研究［27-29］報道打頂后煙堿含量升高，其他代謝物變化的報道包括打頂后上部葉谷氨酰胺及天冬酰胺合成酶活性升高［30］，打頂后上部新葉生長素含量下降［31］。我們的研究結(jié)果表明，打頂后生物堿合成通路整體上調(diào)，天冬酰胺含量顯著升高，谷氨酰胺含量也有升高趨勢，雖未測到生長素，但生長素前體色氨酸含量降低。

圖6 打頂對上部鮮煙葉中氨基化合物生物合成的影響Fig.6 Effects of topping on amino metabolite biosynthesis of upper tobacco leaves

3 結(jié)論

建立了一種基于柱前衍生-超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的植物提取液中氨基化合物代謝譜分析方法。該方法充分利用了不同串聯(lián)質(zhì)譜的技術(shù)特點，對衍生后植物提取液中的氨基化合物進(jìn)行分析。通過UHPLC-QQQ MS 母離子掃描，可特異性地發(fā)現(xiàn)其中的氨基化合物；進(jìn)一步通過UHPLC-Q-TOF MS 高分辨質(zhì)譜全掃描和二級質(zhì)譜掃描對所檢測到的氨基化合物進(jìn)行定性；在此基礎(chǔ)上，再通過UHPLC-QQQ MS 的MRM 模式進(jìn)行氨基化合物的高靈敏度檢測。該方法充分利用了三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性和高靈敏度，以及高分辨串聯(lián)質(zhì)譜高質(zhì)量分辨和二級質(zhì)譜在定性方面的優(yōu)勢，可實現(xiàn)未知樣品中氨基化合物高選擇性的發(fā)現(xiàn)和高靈敏度的檢測。該方法可檢測到實際樣品中的氨基化合物涉及小分子胺類、氨基酸代謝、多胺代謝和生物堿代謝通路中的氨基化合物。方法的靈敏度高、選擇性好、線性范圍可達(dá)到3 ～4 個數(shù)量級。該方法不但可用于植物提取液中氨基化合物的檢測，也可以用于其他生物樣品中氨基化合物的分析。

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