張協(xié)光 ， 鄭彥婕， 曾泳艇， 劉文麗

（深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院，廣東 深圳518109）

葡萄酒含有豐富的有機(jī)酸、糖類(lèi)、氨基酸和較多的抗氧化劑（如多酚化合物）。多酚化合物與葡萄的品種、氣候、地理因素、栽培模式及釀造工藝息息相關(guān)，具有良好的抗氧化活性，能消除或?qū)棺杂苫?，有助于抗衰老以及預(yù)防各類(lèi)疾?。?-3］，因此，研究葡萄酒中多酚類(lèi)化合物的分析方法具有重要的意義。

葡萄酒中多酚化合物的檢測(cè)方法主要有比色法［4］，氣相 色譜-質(zhì) 譜聯(lián) 用法［5］，高 效 液 相 色 譜法［6-11］，高效液相色譜-紫外、質(zhì)譜雙檢測(cè)器 檢測(cè)［12］，高效液相色譜-電化學(xué)、紫外雙檢測(cè)器檢測(cè)法［13］。比色法無(wú)法區(qū)分每種化合物，氣相色譜-質(zhì)譜法需要衍生，步驟復(fù)雜，而液相色譜法因其選擇性好逐漸成為主流方法，但是多種化合物的有效分離仍然是難點(diǎn)。Castellari 等［7］采用RP C18 柱分離17 種多酚化合物，Goncalves 等［8］采用T3 柱在10 min 內(nèi)分離16 種多酚化合物，Torre 等［12］采用C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）分離，通過(guò)紫外檢測(cè)器與質(zhì)譜檢測(cè)器串聯(lián)的方法同時(shí)檢測(cè)24 種多酚類(lèi)化合物。但是這些方法都不是特別理想，葡萄酒基體復(fù)雜，含有的多酚化合物性質(zhì)相似，分離困難，紫外吸收集中在280 ～320 nm 之間，有時(shí)需要用到復(fù)雜的衍生［5］、固相微萃?。?］、固相萃?。?］、液液萃取［10，11，13］等傳統(tǒng)技術(shù)，造成多酚含量的損失與變化，這些都是多酚類(lèi)化合物分析的難點(diǎn)。

線(xiàn)性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱組合式高分辨質(zhì)譜（LTQ／Orbitrap MS）兼有離子阱和高分辨質(zhì)譜平行檢測(cè)的能力，離子阱的多級(jí)質(zhì)譜可獲得結(jié)構(gòu)碎片，高分辨質(zhì)譜可獲得精確質(zhì)量數(shù)，這些技術(shù)的結(jié)合為分析復(fù)雜混合物提供了一種耐用和可靠的方式，能成功鑒定和分析待測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)，對(duì)未知物進(jìn)行篩查。隨著近年來(lái)高分辨質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用，其綜合識(shí)別技術(shù)得到快速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥［14，15］、激素［16，17］、藥 物［18］、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［19］、色素［20，21］等的 分析。但將Orbitrap 高分辨質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于葡萄酒中多酚化合物的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道。本文建立了超高效液相色譜-線(xiàn)性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-LTQ／Orbitrap MS）直接分析葡萄酒中38種多酚類(lèi)化合物的方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Accela 超高效液相色譜儀，LTQ Orbitrap XL液相色譜／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀，NIST MS Search 2.0 質(zhì)譜庫(kù)，均來(lái)自美國(guó)ThermoFisher公司。

甲酸、甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)Merck 公司），實(shí)驗(yàn)用純水由Milli-Q 超純水器（美國(guó)Millipore 公司）制備。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：38 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich 公司，純度≥98%。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取適量多酚類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品，用5% 甲醇水分別配制成有效質(zhì)量濃度為100 mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于-18 ℃下保存。使用時(shí)，根據(jù)需要用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品溶液的制備

樣品采用直接進(jìn)樣法。樣品在分析前室溫避光保存，開(kāi)瓶后，馬上轉(zhuǎn)移到棕色瓶中，迅速蓋上避免氧化，置于-4 ℃下避光保存，以備重復(fù)分析。上樣前取2 mL 樣品過(guò)0.22 μm PES 濾膜。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Hypersil Gold C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國(guó)ThermoFisher 公司）；流動(dòng)相A 為0.1% 甲酸水溶液，B 為0.1% 甲酸乙腈，流速200 μL／min；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序：0.00～1.00 min，95% A；1.00 ～15.00 min，95% A ～40% A；15.00 ～16.00 min，40% A ～5% A；16.00～17.00 min，5% A；17.00 ～18.00 min，5% A ～95% A；18.00 ～20.00 min，95% A。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化方式：電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）；噴霧電壓：2.5 kV；蒸發(fā)溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃；鞘氣（N2）壓力：345 kPa（即50 arb）；輔助氣（N2）流量：1.7 L／min（即5 arb）；最大離子注入時(shí)間：一級(jí)全掃描300 ms，多級(jí)掃描150 ms。掃描方式：負(fù)離子掃描。通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)量校正；掃描范圍：m／z 50 ～1 000，掃描分辨率：30 000。數(shù)據(jù)依賴(lài)掃描范圍：m／z 50 ～800。在分辨能力為7 500時(shí)分析全掃描中強(qiáng)度最高的離子做二級(jí)質(zhì)譜掃描；碎裂方式：高能量碰撞（CID），能量35%。38 種多酚化合物的分析參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品的提取

葡萄酒的基質(zhì)比較復(fù)雜，含有糖、酒、酸、無(wú)機(jī)鹽等物質(zhì)，采用二極管陣列（photo-diode array）檢測(cè)器有時(shí)需要采用復(fù)雜而困難的前處理技術(shù)［8，9，11］，這容易造成提取不完全或由于氧化而導(dǎo)致樣品含量測(cè)試不準(zhǔn)。本文采用直接進(jìn)樣法［6，7，12］，由于葡萄酒中多酚化合物含量大部分在mg／kg 以上［6-10，12，13］，而直接進(jìn)樣的檢出限在0.002 ～0.50 mg／kg，無(wú)需復(fù)雜的前處理，方法完全能滿(mǎn)足檢測(cè)要求，部分含量高的樣品可用初始流動(dòng)相稀釋后再進(jìn)樣檢測(cè)。

表1 38 種多酚化合物的UPLC-LTQ／Orbitrap MS 分析參數(shù)Table 1 Analytical parameters of UPLC-LTQ／Orbitrap MS for the 38 polyphenols

2.2 色譜／質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本文采用Hypersil Gold C18 柱對(duì)多酚化合物標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的分離條件進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)多酚化合物均能達(dá)到良好的分離效果，該色譜柱1.9 μm粒度的填料能大大提升色譜柱的性能，獲得更高的分離度。對(duì)流動(dòng)相組成、甲酸濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，采用0.1% （v／v）甲酸水溶液和0.1% （v／v）甲酸乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在最佳分離條件下，多酚化合物能夠得到良好的基線(xiàn)分離，峰形合理，基質(zhì)干擾小。色譜圖如圖1 所示。

二級(jí)質(zhì)譜掃描比較了CID（collision induced dissociation，碰撞誘導(dǎo)解離）模式與HCD（higher energy collision dissociation，高能量碰撞解離）［19］模式，雖然采用HCD 可有效地避免1／3 效應(yīng)［21］，但是其能量碰撞力度較小，并且多數(shù)多酚在“1／3”之間不存在碎片離子，比較發(fā)現(xiàn)CID 模式更能有效地碰撞產(chǎn)生子離子。以?xún)翰杷兀╟atechin）為例，見(jiàn)圖2a，b。

圖1 負(fù)離子掃描模式下38 種多酚化合物（1.0 mg／L）的特征離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 38 polyphenols （1.0 mg／L）in negative scan mode

圖2 不同裂解模式及碰撞能量下兒茶素的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of catechin in different collision modes with different collision energies

因此，采用CID 模式，碰撞能量35% 作二級(jí)質(zhì)譜圖，將標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖導(dǎo)入NIST MS Search 2.0 中建立二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)。實(shí)際樣品分析中提取可疑物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中標(biāo)準(zhǔn)樣品的二級(jí)質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，對(duì)可疑物質(zhì)進(jìn)一步確證。38種多酚標(biāo)準(zhǔn)品的碎片離子見(jiàn)表2。

2.3 方法的線(xiàn)性關(guān)系、檢出限、回收率與精密度

提取精確質(zhì)量數(shù)的色譜圖噪聲幾乎可以忽略，本方法采用基質(zhì)空白提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至儀器所能檢出的最低濃度，重復(fù)進(jìn)樣，根據(jù)測(cè)試結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差確定檢出限［17，20，21］。以化合物濃度（x，mg／kg）和準(zhǔn)分子離子峰面積（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到各化合物的線(xiàn)性回歸方程、線(xiàn)性范圍和檢出限，見(jiàn)表3。

表2 38 種多酚化合物在CID 裂解模式下產(chǎn)生的碎片離子（碰撞能量為35%）Table 2 Product ions of the 38 polyphenols in CID modes （collision energy 35%）

表3 38 種多酚化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線(xiàn)性范圍和檢出限Table 3 Calibration curves （y ＝ax＋b），correlation coefficients （R2），linear ranges，limits of detection （LODs）of the 38 polyphenols

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

樣品采用直接加標(biāo)測(cè)試回收率，采用1、3、10 倍定量限（線(xiàn)性范圍的最低點(diǎn)）進(jìn)行分析，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，回收率在90% ～102% 之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.51% ～2.56% 之間（見(jiàn)表4），完全滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)分析要求。

表4 空白樣品中3 個(gè)加標(biāo)水平的38 種多酚化合物的回收率范圍及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Recovery ranges and RSDs of the 38 polyphenols at three spiked levels

表4 （續(xù)）Table 4 （Continued）

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

對(duì)葡萄酒中的多酚化合物進(jìn)行檢測(cè)，高分辨質(zhì)譜能夠避免其他方法中干擾雜質(zhì)存在的不足，大大降低假陽(yáng)性的出現(xiàn)率。以本研究建立的方法對(duì)進(jìn)口及國(guó)產(chǎn)的28 個(gè)葡萄酒樣品進(jìn)行了分析測(cè)定，大部分葡萄酒含有17 種多酚化合物（沒(méi)食子酸、原兒茶酸、原花青素B1、綠原酸、兒茶素、對(duì)羥基苯甲酸、龍膽酸、原花青素B2、咖啡酸、表兒茶素、金絲桃苷、對(duì)香豆酸、楊梅素、木樨草素、槲皮素、白藜蘆醇、山柰酚），另外21 種多酚化合物未檢出。有兩個(gè)葡萄酒樣品未檢出任何多酚化合物，疑是假冒葡萄酒，經(jīng)檢查含有非法色素，確是假冒產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本研究建立了葡萄酒中多酚化合物的超高效液相色譜-線(xiàn)性離子阱／靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜篩查和確證方法，方法簡(jiǎn)便、快速、高通量，選擇性高，抗干擾性強(qiáng)，定性結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠有效地用于葡萄酒打假、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值研究、多酚化合物的變化規(guī)律等研究。

［1］ Silberberg M，Morand C，Mathevon T，et al. Eur J Nutr，2006，45（2）：88

［2］ Bagchi D，Bagchi M，Stohs S J，et al. Toxicology，2000，148：187

［3］ Yuan X Y. Modern Agricultural Science and Technology （袁歆貽. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技），2014（13）：311

［4］ Fang Y L，Meng J F，Zhang A，et al. Food Science （房玉林，孟江飛，張昂，等. 食品科學(xué)），2011，32（11）：14

［5］ Soleas G，Goldberg D M. Methods Enzymol，1999，299（13）：137

［6］ Lopez M，Martinez F，Del Valle C，et al. J Chromatogr A，2001，922：359

［7］ Castellari M，Sartini E，F(xiàn)abiani A，et al. J Chromatogr A，2002，973：221

［8］ Goncalves J，Mendes B，Silva C，et al. J Chromatogr A，2012，1229：13

［9］ Li Y K，Li X J，Ou X H. Food Science （李永庫(kù)，李曉靜，歐小輝. 食品科學(xué)），2008，29（4）：283

［10］ Xu T T，Su L Q. Chemical Industry Times （許婷婷，蘇立強(qiáng). 化工時(shí)刊），2013，27（1）：17

［11］ Xing H，Zhang Y T，Lu X F，et al. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae （邢航，張媛婷，魯雪峰，等. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志），2013，19（21）：127

［12］ Torre G，Saitta M，Vilasi F，et al. Food Chem，2006，94：640

［13］ Kolouchova-Hanzlikova I，Melzoch K，F(xiàn)ilip V，et al. Food Chem，2004，87：151

［14］ Farre M，Pico Y，Barcelo D. J Chromatogr A，2014，1328：66

［15］ Rajski L，Gomez-Ramos M，F(xiàn)ernandez-Alba A. J Chromatogr A，2014，1360：119

［16］ Nielen M，Engelen M，Zuiderent R，et al. Anal Chim Acta，2007，586：122

［17］ Li Z Y，Wang F M，Niu Z Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （李兆永，王鳳美，牛增元，等. 色譜），2014，32（5）：477

［18］ Bijlsma L，Emke E，Hernandez F，et al. Anal Chim Acta，2013，768：102

［19］ Regueiro J，Sanchez-Gonzalez C，Vallverdu-Queralt A，et al. Food Chem，2014，152：340

［20］ Li Y L，Zheng Y J，Xiong C，et al. Chinese Journal of Chromatography （黎永樂(lè)，鄭彥婕，熊岑，等. 色譜），2013，31（8）：729

［21］ Xiu X L，Luo X，Niu Z Y，et al. Chinese Journal of Chromatography （修曉麗，羅忻，牛增元，等. 色譜），2013，31（10）：961