王新穎，劉冬青

（青島科技大學(xué)，山東青島266042）

囊性纖維化疾病調(diào)節(jié)劑的研究進展

王新穎，劉冬青

（青島科技大學(xué)，山東青島266042）

囊性纖維化是在白種人中最常見的危及生命的常染色體隱性遺傳病，由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子基因突變引起，囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子也因此成為藥物研發(fā)的靶點。按引發(fā)囊腫性纖維化的原因，可將囊腫性纖維化突變分為五類。本文主要介紹治療前三類基因突變的調(diào)節(jié)劑，這些制劑為囊性纖維化患者帶來了福音。

囊性纖維化；囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子；調(diào)節(jié)劑

1 介紹

1.1 CFTR突變的分類

囊性纖維化（CF）是由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）基因突變引起的遺傳性疾病。CFTR可在轉(zhuǎn)錄、折疊、轉(zhuǎn)運、降解、通道開放水平上影響蛋白質(zhì)的生物合成與活性。CFTR氯離子和碳酸氫根離子電導(dǎo)活性的缺乏會降低上皮層頂端表面的水和pH，導(dǎo)致粘液積聚在胰腺、腸、睪丸、肝和肺中[1]。肺部感染和發(fā)炎是囊性纖維化發(fā)病和死亡的主要原因[2]。

在CFTR中存在超過1900種引發(fā)囊性纖維化的突變，我們將其分為五類[3]。Ⅰ類突變（CF患者中的10%）阻礙了CFTR蛋白的合成。Ⅱ類突變（CF患者中的70%）抑制了CFTR蛋白的折疊和穩(wěn)定性，使其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中降解，阻止了其轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面。Ⅱ類突變的共同特征是Phe508的缺失造成的。Ⅲ類突變（CF患者中的2%～3%）是門控突變，正常轉(zhuǎn)運到細(xì)胞表面但通道活性降低。Ⅳ類突變（＜2%）降低了通過蛋白通道的離子的電導(dǎo)率。Ⅴ類突變（＜1%）一般存在剪接缺陷，降低了CFTR蛋白的表達而沒有改變氨基酸序列[4]。Ⅳ、Ⅴ類突變比前三類突變的臨床癥狀要緩和[5]。

不同類型的突變有不同的治療策略。促進識別終止密碼子的化合物，可從mRNA合成功能CFTR，從而治療一類突變。通過增強蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到蛋白質(zhì)表面的水平或直接作用于錯誤折疊的CFTR蛋白或改善蛋白質(zhì)的折疊環(huán)境可治療二類突變。通過改善蛋白表面的通道活性可治療三類突變。這些化合物通常根據(jù)它們治療主要蛋白缺陷的能力來分類，但這些制劑也可聯(lián)合使用以增強療效。

1.2 細(xì)胞分析

利用工程細(xì)胞系對化合物庫進行高通量篩選來鑒別突變CFTR調(diào)節(jié)劑。這類細(xì)胞系已經(jīng)成功用于鑒別校正劑和增效劑。這種細(xì)胞系通常被設(shè)計為表達CFTR的突變形式，特別是F508del。通過分析膜蛋白的改變或?qū)u化物敏感的熒光蛋白受體熒光淬滅的增強來測量依賴于F508delCFTR的離子電導(dǎo)率。

最近，從F508del和其它引起突變的患者體內(nèi)分離得到了腸細(xì)胞組織體，并已經(jīng)得到了一種不依賴突變CFTR外源表達的細(xì)胞體系，該體系對化合物庫的篩選是一種有益的新方法。

CFTR突變的病理生理學(xué)后果在肺部最嚴(yán)重，肺細(xì)胞是評估表型解救的黃金標(biāo)準(zhǔn)。分離的原代人支氣管上皮細(xì)胞(HBEs),在氣-液界面處是分化的，氣液界面處充分再現(xiàn)了其天然環(huán)境以至于在體外用分化良好的細(xì)胞可以觀測到協(xié)調(diào)的纖毛跳動和黏液產(chǎn)量。在尤斯灌流室中用HBEs進行電生理學(xué)研究直接提供了內(nèi)源性突變CFTR氯化物的電導(dǎo)活性的測量。

應(yīng)用功能分析去得到構(gòu)效關(guān)系再得到臨床候選藥物，說明了用表型篩選去發(fā)現(xiàn)藥物的價值。

1.3 調(diào)整呼吸道表面液體缺陷的其他策略

這篇文章主要討論利用小分子通過提高蛋白質(zhì)表達、轉(zhuǎn)運或增強它的開放來校正CFTR功能。雖然基因治療能有效治療任何CFTR突變，但用此方法需要克服人體的免疫防衛(wèi)，這是一大挑戰(zhàn)。在CF患者呼吸道內(nèi)減少水分和嚴(yán)重的炎癥已經(jīng)成為治療目標(biāo)。一些有效治療CF疾病的方法包括：通過抑制上皮細(xì)胞鈉通道（ENaC）來阻斷鈉吸收（GS9411, GS5737，picolinamides）,通過離子載體刺激激活的氯化鈣通道，通過P2Y2受體（denufosol）感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平以及使用抗炎劑(BIIL 284 BS，CTX-4430)[6]。

2 治療一類缺陷

2.1 Ataluren(PTC124，圖1)

圖1

Ataluren是一種通讀制劑，可抑制PTCs，恢復(fù)功能蛋白生產(chǎn)[7,8]，但它的作用機制一直存在爭議。Ataluren在一類突變的CF患者中進行測試，患者的一秒用力呼氣容積（FEV1）提升了約3%。亞群分析顯示，沒有用氨基糖苷類抗生素治療的患者的FEV1提升了6%[9]，目前Ataluren正在沒有用氨基糖苷類抗生素治療的患者中進行三期臨床試驗。

2.2 NB124(圖2)

圖2

NB124[10]是一類合成氨基糖苷類抗生素，通過去除調(diào)節(jié)抗菌作用的結(jié)構(gòu)成分而保留促進PTCs通讀的成分設(shè)計得到。對一類突變非常有效，比第一代化合物的治療指數(shù)強10倍，與Ivacaftor(一種增效劑，Compound 12)聯(lián)合使用可進一步增強其活性。

3 治療二類缺陷（校正劑）

校正劑是幫助二類突變的CFTR克服折疊、穩(wěn)定性、降解而到達細(xì)胞表面的化合物。最常見的CFTR突變是F508del突變。二類突變占所有CFTR突變的70%。調(diào)查顯示，87%的CF患者至少有一個F508del，47%是純合子，40%是F508del結(jié)合另一引起CF突變的雜合子。最近的研究提供了一些校正F508del折疊和轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)劑[11]。治療策略包括用藥理學(xué)分子伴侶直接修正F508delCFTR[12]，增強折疊環(huán)境，調(diào)整由于增強突變蛋白的表達和穩(wěn)定性而造成的細(xì)胞壓力。校正CFTR轉(zhuǎn)運的化合物在其它蛋白質(zhì)折疊/轉(zhuǎn)運疾病中也顯示出了療效。

3.1 VX-809(圖3)

圖3

在原發(fā)性患者的F508del/F508del人支氣管上皮細(xì)胞（HBEs）中，校正劑VX-809使氯離子流量提高到非CF患者HBEs的14%，Ivacaftor可達到9%，兩者結(jié)合使用可達到25%。VX-809最可能是一種藥物分子伴侶，穩(wěn)定蛋白質(zhì)突變體的NBD1域和第一個跨膜域(MSD1)的相互作用。

在臨床試驗中，純合子的F508del患者，單獨用單劑量的VX-809或Ivacaftor都不能顯著提高FEV1，而兩者聯(lián)合使用可使FEV1提高2.8%～3.3%。

3.2 VX-661(圖4）

VX-661是第二個F508delCFTR校正藥物，目前正在進行臨床Ⅱ期實驗。它協(xié)助CFTR蛋白到達細(xì)胞表面，使F508delCFTR突變通道避免降解且轉(zhuǎn)運到細(xì)胞膜上。在原發(fā)性患者的F508del/F508del HBEs中，校正劑VX-661使氯離子流量提高到非CF患者HBEs的9%，Ivacaftor也可達到9%，兩者結(jié)合使用可達到26%。

3.3 407882(圖5)

用DOCK程序?qū)508delNBD1進行基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，得到了新的F508del轉(zhuǎn)運校正劑[13]。它干擾NBD1和角蛋白8的相互作用，1μM就可使F508delHBEs活性達到非CF患者HBE活性的15%。

圖4

圖5

3.4 Matrine(圖6)

圖6

分子伴侶質(zhì)量控制通路的調(diào)節(jié)也是校正有缺陷的CFTR折疊的一種有效策略。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿（Matrine）[14]抑制分子伴侶Hsc70從ER釋放F508del?CFTR到細(xì)胞表面，致使在細(xì)胞表面有比較高的F508del蛋白水平。

3.5 Apoptozole(圖7)

圖7

Apoptozole[15]結(jié)合Hsc70和Hsp70，解離常數(shù)分別為0.21μM和0.14μM。該化合物通過阻礙突變體與Hsc70分子伴侶和泛素化連接酶的相互作用來抑制F508delCFTR的泛素化，從而增強轉(zhuǎn)運和細(xì)胞表面的穩(wěn)定性。在F508del-CFTR表達的人類胚胎腎細(xì)胞（HEK）中，200nM的Apoptozole使氯離子通道活性達到野生型CFTR(wt-CFTR)表達細(xì)胞的20%。

3.6 Latonduine A(圖8)

圖8

通過篩選太平洋海洋海面提取物發(fā)現(xiàn)了可修正F508del錯誤折疊的校正劑Latonduines，使CFTR轉(zhuǎn)運能力提高到wt-CFTR表面表達的45%[16]。

3.7 激酶抑制劑

在激酶抑制劑化合物庫中篩選得到可以恢復(fù)F508delCFTR活性的化合物，研究顯示，以FGFR/ FEGFR/PDGFR為靶點的激酶抑制劑SU5402,以及以Ras/Raf/MEK/ERK/p38,和GSK-3β為靶點的激酶抑制劑kenpaullone可使F508del恢復(fù)到wt-CFTR 的10%～30%。

3.8 其它校正劑

研究表明蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)劑單獨使用在HBEs中有活性，也可與其它校正劑聯(lián)合使用來增強校正劑的療效。四環(huán)素通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)環(huán)境來發(fā)揮校正作用。Ambroxol可提高CF患者細(xì)胞內(nèi)CFTR 和ENaC表達以及氯離子轉(zhuǎn)運。

4 治療三類缺陷（增效劑）

4.1 VX-770(圖9)

Ivacaftor是第一個獲批的治療CF的制劑，他在2012年1月被批準(zhǔn)治療G551D突變的患者（占CF患者的4.3%）[17]。來自PERSIST的數(shù)據(jù)分析顯示，用Ivacaftor進行了144周的持續(xù)治療，其可在肺功能（FEV1提高了6%）、體重等方面持續(xù)發(fā)揮作用。

圖9

4.2 RP193(圖10)

圖10

有研究報道，CDK/GSK-3β抑制劑RP193可校正F508del，它對野生型、F508del和G551D CFTR都有效。吡咯并[2,3-b]吡嗪系列化合物的構(gòu)效關(guān)系表明，RP193使CFTR增強的同時有較低的毒性。

4.3 其他的增效劑

已經(jīng)報道的其他的增效劑還有白藜蘆醇、去氫木香內(nèi)酯和Dihydropyridines。

5 有雙重活性的化合物

為了充分優(yōu)化F508delCFTR的功能活性，必須既校正轉(zhuǎn)運缺陷，又增強在細(xì)胞表面的通道開放。為此可將校正劑與增效劑聯(lián)合使用或者尋找有這兩種活性的化合物。有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有校正劑和增效劑雙重活性的化合物，可在一次治療中同時改善兩種功能缺陷。此外，一些有抗炎活性的化合物也同時具有F508del CFTR校正劑和增效劑的活性。

5.1 N6022

研究表明，S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（GSNOR）抑制劑同時具有抗炎、CFTR校正劑和增效劑活性，它作用于Hsp70/Hsp90組織蛋白(Hop)通道而發(fā)揮作用。N6022是一種GSNOR抑制劑，IC50為8nM，已經(jīng)被批準(zhǔn)用于F508delCFTR患者[18]。

5.2 CoPo-22

氰基喹啉類化合物CoPo-22通過高通量篩選得到[19]。研究顯示，此化合物既可只做校正劑或增效劑，也可同時具有這兩種活性。分子建模顯示在氰基喹啉和芳香酰胺間的柔性鏈和相對較短的連接是重要的CoPo特性。

5.3 Hyalout4(圖11)

圖11

CFTR不僅生成天然水化物也生成透明質(zhì)酸。Hyalout4以二芳基類似物為基礎(chǔ)，模仿透明質(zhì)酸鏈的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特點，從而增強了膜滲透性，既可用作F508delCFTR校正劑，也可用作增效劑[20]。

6 結(jié)論

治療囊性纖維化能延長此病患者的壽命，改善患者的生活質(zhì)量，如今，囊性纖維化患者的壽命已由28歲延長到了38歲。然而，從意識到CFTR基因缺陷到第一個制劑上市花費了28年。對由CFTR門控突變引發(fā)的三類說明了用小分子治療CF的可能，但仍需要開發(fā)大量藥物來治療二類CF，Ivacaftor的上市說明了用小分子治療CF的可能，但仍需要開發(fā)大量藥物來治療二類CF，探索多種校正多元缺陷的方法。這些策略的聯(lián)合使用是治療F508delCF的成功方法，有希望治愈所有的CF患者。

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·信息·

“皮塑廢棄物粉體相容增強關(guān)鍵技術(shù)及其循環(huán)應(yīng)用”榮獲浙江省科技二等獎

在浙江省政府召開全省科學(xué)技術(shù)獎勵大會上，浙江豐利粉碎設(shè)備有限公司和寧波工程學(xué)院合力研發(fā)的“皮塑廢棄物粉體相容增強關(guān)鍵技術(shù)及其循環(huán)應(yīng)用”項目榮獲技術(shù)發(fā)明二等獎。該項目有效實現(xiàn)了皮塑廢棄物粉碎裝備產(chǎn)業(yè)化，皮粉增強橡膠制品生產(chǎn)以及回收塑料的再生資源化利用等，取得了良好的社會和生態(tài)效益。

浙江豐利攜手寧波工程學(xué)院，從2007年開始產(chǎn)學(xué)研合作，合力攻關(guān)皮革廢棄物資源化利用課題，共同承擔(dān)的“皮革廢棄物用作橡塑填充材料技術(shù)開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化”項目列入浙江省2008年度第一批重大科技專項。為進一步推進這一工程，又于2009年8月1 8日成立了“廢棄生物質(zhì)資源化及裝備工程技術(shù)中心”。2013年7月，該項目在寧波工程學(xué)院首次通過教育部科技成果鑒定。通過近10年的不懈努力，終于突破了粉碎裝置和相容增強等關(guān)鍵技術(shù)，并實現(xiàn)了多項產(chǎn)品的循環(huán)應(yīng)用。該項目共發(fā)表學(xué)術(shù)論文48篇，其中SCI/EI論文13篇；獲得授權(quán)中國發(fā)明專利5件，授權(quán)實用新型專利5件，申請中國發(fā)明專利9件。該項成果在固體廢棄物的循環(huán)利用方面獲得了多項創(chuàng)新技術(shù)，在皮/塑廢棄物綜合利用及其復(fù)合材料技術(shù)領(lǐng)域達到國際先進水平。

項目實施以來，已在江浙滬等省市推廣應(yīng)用，有效減量消耗處理廢塑料、廢棄皮革等固廢，使之變廢為寶，促進循環(huán)經(jīng)濟發(fā)展，改善人們居住環(huán)境生態(tài)條件，保證環(huán)境生態(tài)文明，樹立良好形象提供強有力的地支撐。

（吳紅富）

10.3969/j.issn.1008-1267.2015.04.002

TQ463+.5

A

1008-1267（2015）04-0004-05

2015-03-18