李榮春，張玉金

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食用菌研究所，云南 昆明 650201；2.遵義醫(yī)學院藥學院，貴州 遵義 563000）

蘑菇屬9個種20個菌株的遺傳關系

李榮春1，張玉金2

（1.云南農(nóng)業(yè)大學食用菌研究所，云南 昆明 650201；2.遵義醫(yī)學院藥學院，貴州 遵義 563000）

以Atp6、ITS、Rpb2基因片段分別構建了蘑菇屬中9個種 [白蘑菇（Agaricus bisporus）、奶油蘑菇（棕色蘑菇） （A.bisporus）、（四孢）蘑菇（A.campestris）、大肥菇（A.bitorquis）、大紫蘑菇（A.auqustus）、野蘑菇（A.arvensis）、姬松茸（A.blazei）、酒色蘑菇（A.subrutilescens）、白林地蘑菇（A.silvicola）]20個菌株的分子遺傳關系無根樹。結果表明，ITS、Rpb2基因片段能夠從某種程度對實驗材料中的蘑菇種類進行區(qū)分；但Atp6基因片段因為進化較慢，其區(qū)分能力較差，不適于研究蘑菇屬的遺傳多樣性。同時3個基因的聯(lián)合分析較單一基因具有更好的分辨能力，所構建的親緣關系樹，可將9個種20個菌株劃分為4個大的支系，進一步劃分為7個明確的類群。

蘑菇屬；基因序列；遺傳關系

蘑菇屬（Agaricus），又稱傘菌屬或黑傘屬，隸屬于傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae），該屬不少于300個種[1]。蘑菇屬中的雙孢蘑菇（A.bisporus）不僅味道鮮美、營養(yǎng)價值高，而且具有較高的藥用價值，是當前全球化栽培的食用菌，其栽培面積、栽培產(chǎn)量和栽培技術均居栽培食用菌之首[2-3]。蘑菇屬大多數(shù)種類可供食用或藥用，基本都是草腐菌，栽培技術相對簡單。從蘑菇屬種中選育出更多具有較高經(jīng)濟價值的種類，是當前蘑菇屬研究的熱點，姬松茸（Agaricus blazei）就是近年來馴化且大規(guī)模栽培的蘑菇屬中的一種重要食用菌，（田）野蘑菇（Agaricus arvensis）、林地蘑菇（Agaricus silvicola） 也是正在馴化的新種類[4-5]。

種質(zhì)資源的收集與鑒定是進行馴化等開發(fā)利用的前提，理清蘑菇屬各種間的親緣關系將從遺傳層面，為資源的選擇性開發(fā)提供科學決策。本文作者此前采用AFLP指紋技術，對雙孢蘑菇的20個野生菌株和5個栽培品種的遺傳多樣性進行了初步研究，發(fā)現(xiàn)：在野生菌株之間存在著明顯的遺傳差異；大多數(shù)單孢分離的菌株具有與母本一致的遺傳物質(zhì)；野生菌株間的遺傳變異大于栽培品種間的變異[3]。隨著分子標記的進一步發(fā)展，以基因測序為手段的遺傳多樣性分析技術得到了廣泛的運用。在此基礎上本文以來自美國和中國的蘑菇屬可栽培的9個種的20個菌株為研究材料，采用分子系統(tǒng)學的研究方法，對3個基因（ITS、RPB2和ATP6）進行了擴增，并依此構建了菌株間的基因樹，初步探討了它們的遺傳關系，同時，評價了3個基因區(qū)分蘑菇屬種類的能力，為后續(xù)更多蘑菇屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析奠定基礎。

1　材料與方法

1.1供試材料

本研究所使用的20個蘑菇屬菌株中有17份材料來自于美國，3份材料來自中國的云南和福建。各菌株的詳細情況見表1。

表1　蘑菇屬9個種20個菌株及其來源Tab.1　The material list for analysis in this study

2.1方法

2.1.1DNA提取

采用CTAB（hexadecyl trimethy lammonium bromide）法提取蘑菇菌絲體中的DNA[6]。

2.1.2基因片段的擴增及測序

采用引物Atp6-1（5’-ATTAATTSWCCWTTAGAWCAATT-3’）、Atp6-2（5’-TAATTCTANWGCATCTTTAATRTA-3’） 聯(lián)合Atp6-3（5’-TCTCCTTTAGAACAATTTGA-3’）、Atp6-4（5’-AAGTACGAAWACWTGWGMTTG-3’）共同完成對Atp6基因的擴增。PCR擴增采用30 μL的反應體系：2× Master Mix 15 μL、Atp6-1（20 μmol·L-1） 1 μL、Atp6-2（20 μmol·L-1）1 μL、總DNA 1 μL、ddH2O 12 μL。反應程序為94℃預變性7 min，之后進行35個擴增循環(huán)（94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s），最后72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物4℃保存[7]。

采用引物 ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’、ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’擴增ITS片段。PCR擴增采用30 μL的反應體系：2×Master Mix 15 μL、ITS1（20 μmol·L-1） 1

μL、ITS4（20 μmol·L-1） 1 μL、總 DNA 1 μL、ddH2O 12 μL。反應程序為94℃預變性7 min，之后進行35個擴增循環(huán)（94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s），最后72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物4℃保存[8]。

采用引物RPB2-6F：5’-TGGGGTCTTGTCT GCCCGGC-3’、RPB2-7R：5’-CCCATTGCCTGCT TACCC AT-3’擴增Rpb2基因。PCR擴增采用30 μL的反應體系：2×Master Mix 15 μL、RPB2-6F（20 μmol·L-1） 1 μL、RPB2-7R（20 μmol·L-1） 1 μL、總DNA 1 μL、ddH2O 12 μL。反應程序為94℃預變性7 min，之后進行35個擴增循環(huán)（94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s），最后72℃延伸7 min，PCR產(chǎn)物4℃保存[9]。

3個基因片段的PCR產(chǎn)物送測序公司測序。對序列的正、反鏈進行測定并加以校準，確保測序的準確性。

2.1.3分子系統(tǒng)關系樹的構建

首先，逐一將所測測序結果粘貼于NCBI（National Center of Biotechnology Information）網(wǎng) 站BLAST搜索框中，搜索該標本的同源序列，大概了解此實驗所得序列是否為標本物種序列而非其他。其次，將各標本實驗所得序列于BioEdit（Version 7.0.5.3）[10]中合并成一個Fasta文件。再與上一步合并序列進行比對，序列比對在MAFFT（multiple alignment using fast Fourier transform）[11]進行，選擇最精確選項L-INS-i（空位罰分1.5、延伸空位罰分0.14）進行比對計算，比對結束截去序列矩陣前后不齊部分使之整齊，比對后序列用于關系樹的構建。

在進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建之前保存成PAUP（phylogenetic analysis using parsimony） 識別的Nexus格式，之后用Modeltest（Version 3.7）對核苷酸替換最適數(shù)據(jù)模型進行篩選。采用PAUP 4.0軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，空位被處理為缺失。最大簡約性分析采用如下選項完成，即：樹二組重新連接（tree bisection-reconnection，TBR)、啟發(fā)式搜索 （heuristic search）、多重性選擇（multrees option）、ACCTRAN優(yōu)化和1 000次隨機附加的重復。利用Bootstrap（1 000次重復）檢驗各分支的置信[12]。

2　結果與分析

經(jīng)相應引物擴增和測序，明確了蘑菇屬真菌Atp6基因長度在904 bp左右。經(jīng)多菌株同一序列的比對分析發(fā)現(xiàn)：Atp6基因有799個保守位點，67個非信息位點，118個信息位點。所構建的關系樹見圖1。

經(jīng)相應引物擴增和測序，明確了蘑菇屬真菌ITS基因長度在756 bp左右。經(jīng)多菌株同一序列的比對分析發(fā)現(xiàn)：ITS基因有537個保守位點，129個非信息位點，90個信息位點。所構建的關系樹見圖2。

圖1　基于ATP6堿基序列分析所得到的嚴格一致樹Fig.1　Majority-rule consensus tree based on ATP6 genes

圖2　基于ITS堿基序列分析所得到的嚴格一致樹Fig.2　Majority-rule consensus tree based on ITS genes

經(jīng)相應引物擴增和測序，明確了蘑菇屬真菌Rpb2基因長度在637 bp左右。經(jīng)多菌株同一序列的比對分析發(fā)現(xiàn)：Rpb2基因有462個保守位點，122個非信息位點，53個信息位點。所構建的關系樹見圖3。

3個基因片段的聯(lián)合分析，所構建的遺傳差異關系樹見圖4。

圖3　基于Rpb2堿基序列分析所得到的嚴格一致樹Fig.3　Majority-rule consensus tree based on Rpb2 genes

圖4　基于3個基因片段分析所得到的嚴格一致樹Fig.4　Majority-rule consensus tree based on the 3 genes

從蘑菇屬的3個基因片段，以及3個基因片段的聯(lián)合，所構建的親緣關系樹，可將其劃分為4個大的支系，又可進一步劃分為7個明確的類群，見圖4（G1～G7）。

G1類群中包含了白蘑菇、奶油（棕色） 蘑菇（A.bisporus）和（四孢）蘑菇（A.campestris）2個種，但從3個基因片段及其聯(lián)合構建的系統(tǒng)發(fā)育關系看，兩者在遺傳上并無多大差異。奇怪的是，中國主要雙孢蘑菇（A.bisporus）栽培品種2796在ITS基因樹和3基因聯(lián)合的基因樹中，都明顯地與（四孢）蘑菇（A.campestris）聚類到一起，與雙孢蘑菇（A.bisporus）的5個菌株相分開。在RPB2的基因樹中，雙孢蘑菇（A.bisporus）和（四孢）蘑菇（A.campestris）2個種的7個菌株以100的支持率聚類在一起。在ATP6基因樹中，雙孢蘑菇（A.bisporus）和（四孢）蘑菇（A.campestris）的菌株也聚類在一起。這提示我們，雙孢蘑菇（A.bisporus）和（四孢）蘑菇（A.campestris）或許是同一個種。

G1類群與G2類群的親緣關系較近，G2為大肥菇（A.bitorquis）。G1、G2在4棵基因樹中均有較高的支持率，能夠被明顯區(qū)別開。G1、G2構成的第一大分類群在4棵遺傳差異關系樹中，也均有較高的支持率。因此，G1、G2及其所構成的分類群遺傳差異明晰。同時可以看出，ITS序列不管是在G1或是在G2分類群中，對研究材料均具有良好的區(qū)分能力和區(qū)別的層次性。

G3類群包含了大紫蘑菇（A.augustus） 和野蘑菇（A.arvensis）2個種。大紫蘑菇和野蘑菇的菇蓋顏色差異比較大，一個是紫色，一個是白色，但其ITS和RPB2的堿基序列變異較大，在相同的遺傳差異率下，其他支系幾乎均為1個種，所以兩個學名（2種）是否能獨立存在或進行合并，有待更深入的研究。

G3類群、G4類群的遺傳差異較小。G4類群為姬松茸（A.blazei），從3個基因序列可以看出分別來自美國和中國的3個姬松茸菌株無差異，表明姬松茸的種質(zhì)資源單一，缺乏遺傳多樣性，這種遺傳多樣性的缺乏使姬松茸栽培產(chǎn)業(yè)存在著隱形風險。G3類群、G4類群在除Atp6基因片段的其他3棵進化樹中均具有較高的支持率，能夠明顯區(qū)分。G3類群、G4類群有共同的外群，即G5酒色蘑菇（A. subrutilescens），三者共同構成了基因樹的第二大類群，在Rpb2基因片段構建的遺傳關系樹中具有高達96%的支持率。

G6類群為美國加州分離的野生菌株未定名之種，該分類群在Rpb2及聯(lián)合基因片段所構建的蘑菇屬系統(tǒng)發(fā)育樹中居基部，為第一、第二大類群的外群。但在ITS基因片段構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，卻為第一大支系的外群，其與第一、第二大分類群的親緣關系不甚明確。

G7類群為白林地蘑菇（A.silvicola），該分類群在3個基因片段中均得到了很好的區(qū)分，其與其他幾大分類群在遺傳上有明顯差異。

3　結論與討論

從3個基因片段構建的遺傳差異關系樹樹型來看，以Atp6基因片段構建的樹型較為粗糙，如類群G3～G6均未能得到區(qū)分。因此，不適于用Atp6基因研究蘑菇屬的遺傳多樣性。Kretzer和Bruns[7]在采用Atp6研究牛肝菌的系統(tǒng)發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，Atp6僅適用于綱階元的區(qū)別，并不適用于屬的階元，這與本文以蘑菇屬為研究對象所得結論一致。但在植物界中Atp6基因編碼序列變異仍適于研究裸子植物亞屬甚至組間的系統(tǒng)進化關系[14]。ITS在種間具有明顯的進化差異，作為真菌條形碼，在真菌界中用于種的鑒定，ITS序列的進化特征在本研究中得到進一步印證。ITS、Rpb2構建的樹型具有較好的區(qū)分能力和系統(tǒng)性，能夠較好的展現(xiàn)蘑菇屬各種間的遺傳差異。并且3個基因片段聯(lián)合構建的遺傳差異樹樹型與ITS、Rpb2大致相似。ITS對G1類群的系統(tǒng)揭示性優(yōu)于Rpb2，但在G6分類群的遺傳距離上卻與聯(lián)合片段的系統(tǒng)發(fā)育關系有較大的差異，而Rpb2在處理G6分類群時則較為妥當。因此，對蘑菇屬的遺傳多樣性分析可以采用ITS、Rpb2基因片段，聯(lián)合ITS、Rpb2基因片段，其遺傳多樣性分析的結果才比較可靠。

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Relationship Among 20 Strains of Agaricus Based on Three Genomic Sequences Analyses

LI Rong-chun1,ZHANG Yu-jin2
(1.Institute of Edible Fungi,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China; 2.College of Pharmacy,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China)

To evaluate the genetic diversity in some species of Agaricus(A.bisporus,A.bisporus,A.campestris,A.bitorquis,A. auqustus,A.arvensis,A.blazei,A.subrutilescens,A.silvicola)based on the genomic sequences of Atp6,ITS and Rpb2,the phylogenetic tree of 20 Agaricus strains were constructed in this paper.The results showed that the sequences of the ITS and Rpb2 could separate species of Agaricus,but the Atp6 failed.The evolutionary rate of Atp6 seems to be slower than ITS and Rpb2.Twenty strains have been divided into four major clusters and seven groups by combing the three genes.We got more accurate resolution using joint analysis of three geres than using a single gene.

Agaricus;sequences of gene;genetic diversity

S646.1A：1003-8310（2015）05-0045-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2015.05.012

李榮春 (1959-)，男，碩士，教授，主要從事食用菌資源及食用菌栽培技術研究。E-mail:rongchunli@126.com

2015-07-01