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(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

姜黃素以端粒酶為靶點(diǎn)治療Aβ?lián)p傷的體外研究

肖子建，謝明*，周桂娟，蘭芳，鄧琦

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

目的探討端粒酶在姜黃素治療β淀粉樣蛋白(Aβ)損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)中的作用。方法用Aβ1-42(10 μg/mL)預(yù)處理SK-N-SH細(xì)胞建立損傷的細(xì)胞模型后，用姜黃素(10 μg/mL)干預(yù)治療組，處理前后檢測(cè)細(xì)胞存活率、細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平及hTERT的表達(dá)水平，并通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低hTERT的表達(dá)，以此驗(yàn)證端粒酶在姜黃素的干預(yù)作用中所起的作用。結(jié)果Aβ1-42預(yù)處理組的氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞毒性均有顯著增高(P<0.001)，hTERT的表達(dá)水平明顯下降(P<0.001)。姜黃素干預(yù)使SK-N-SH細(xì)胞免受Aβ1-42損傷(P<0.001)并上調(diào)hTERT的表達(dá)水平(P<0.001)。而當(dāng)端粒酶活性被TERT的小分子干擾RNA抑制后，姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用也隨之消失(P>0.05)。結(jié)論姜黃素對(duì)抗Aβ毒性的神經(jīng)保護(hù)作用有賴于端粒酶活性，端粒酶則可能是姜黃素治療效應(yīng)的靶點(diǎn)。

β淀粉樣蛋白； 姜黃素； 端粒酶； 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶

β淀粉樣蛋白(amyloid-beta peptide，Aβ)普遍被認(rèn)為是導(dǎo)致阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)一切神經(jīng)損傷的根源[1]，Aβ的聚積在AD發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[2]。在一些以Aβ為靶點(diǎn)進(jìn)行抑制Aβ聚積并抑制其神經(jīng)毒性的研究中，已發(fā)現(xiàn)一些天然中藥成分可抑制Aβ聚積并且對(duì)抗Aβ神經(jīng)毒性，姜黃素就是這些天然中藥成分中首當(dāng)其沖的典型代表。姜黃素能以脂類介導(dǎo)的自由擴(kuò)散的方式穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入腦組織，與Aβ沉淀形成特異性結(jié)合。本研究團(tuán)隊(duì)先期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)其中姜黃素能有效對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性，促進(jìn)細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)，維持細(xì)胞的正常形態(tài)[3]。本研究通過(guò)觀察姜黃素對(duì)細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平、hTERT表達(dá)水平的影響，通過(guò)觀察RNA干擾導(dǎo)致hTERT表達(dá)降低后，姜黃素對(duì)細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響，探討端粒酶在姜黃素對(duì)抗Aβ毒性的神經(jīng)保護(hù)作用中的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N SH)細(xì)胞株購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

姜黃素、Aβ1-42均購(gòu)自Sigma公司，兔抗人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)單克隆抗體購(gòu)自Millipore公司，活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，谷胱甘肽測(cè)定試劑盒購(gòu)自凱基生物科技發(fā)展有限公司，小分子RNA購(gòu)自蘇州吉瑪公司。

1.2模型建立及分組對(duì)照組：正常培養(yǎng)5天的SK-N SH細(xì)胞，無(wú)特殊處理。Aβ1-42損傷組：將10 μg/mL經(jīng)老化處理的Aβ1-42加入傳代后培養(yǎng)第3天的SK-N SH細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。姜黃素干預(yù)組：將10 μg/mL經(jīng)老化處理的Aβ1-42以及姜黃素(終濃度為10 μg/mL)加入傳代后培養(yǎng)第3天的SK-N SH細(xì)胞中，置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值(OD值)，來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)。

1.4 Western Blot、實(shí)時(shí)定量PCR Western Blot檢測(cè)hTERT蛋白的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定hTERT mRNA的表達(dá)。小分子RNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，驗(yàn)證轉(zhuǎn)染率及轉(zhuǎn)染效率，然后再次利用上述方法進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用MTT檢測(cè)細(xì)胞生存率的結(jié)果顯示，SK-N-SH 細(xì)胞在Aβ1-42處理了24 h之后，生存率約降低至正常水平的61.67% (P<0.001)，而姜黃素對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用(圖1)，姜黃素組與Aβ1-42 組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)，這說(shuō)明姜黃素能對(duì)抗Aβ1-42的毒性作用，從而改善細(xì)胞存活率。

圖1 姜黃素處理細(xì)胞后細(xì)胞存活率MTT檢測(cè)結(jié)果 Aβ1-42組與對(duì)照組比較，*：P<0.001；姜黃素組與Aβ1-42組比較，**：P<0.001

2.2姜黃素上調(diào)hTERT的表達(dá)經(jīng)過(guò)Aβ1-42處理以后，hTERT的蛋白及mRNA水平明顯下降(P<0.001)，說(shuō)明Aβ1-42可明顯抑制hTERT表達(dá)；在姜黃素預(yù)處理后，hTERT的蛋白及mRNA水平下降的趨勢(shì)得以逆轉(zhuǎn)(P<0.001，圖2)，姜黃素可明顯上調(diào)SK-N-SH細(xì)胞中hTERT的表達(dá)，說(shuō)明姜黃素可明顯上調(diào)hTERT表達(dá)。

2.3篩選最高效的siRNA下調(diào)hTERT表達(dá)經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR及western blot檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有siRNA轉(zhuǎn)染后都可下調(diào)hTERT的表達(dá)，在這3條siRNA中，TERT-homo-2919是最高效的(圖3)。本研究選用TERT-homo-2919(GAG CCA GUC UCA CCU UCA ATT UUG AAG GUG AGA CUG GCU CTT)組作為隨后實(shí)驗(yàn)的干擾組。

2.4細(xì)胞經(jīng)RNA干擾后姜黃素?zé)o神經(jīng)保護(hù)作用

經(jīng)MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率，發(fā)現(xiàn)在Aβ1-42處理24 h以后，SK-N-SH細(xì)胞的存活率大約下降至正常水平的61.67%(P<0.001)；在siRNA干擾后，細(xì)胞存活率大約下降至正常水平的55.81%(P<0.001)。此外，經(jīng)siRNA干擾隨后用Aβ1-42處理24 h的胞存活率大約下降至正常水平的36.63%(P<0.001，圖4)。此時(shí)，姜黃素(36.26%)不再顯示出對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。2919+Aβ42組與2919+Aβ42+curcumin組之間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05)。結(jié)果提示在細(xì)胞經(jīng)過(guò)siRNA干擾后，姜黃素對(duì)細(xì)胞喪失了改善細(xì)胞存活率的功能。

圖2 hTERT mRNA水平(A)及蛋白水平(B、C)的定量 Aβ1-42組與對(duì)照組比較，*：P<0.001；姜黃素組與Aβ1-42組比較，**：P<0.001

3 討 論

Aβ促氧化應(yīng)激假說(shuō)[4]指出Aβ的生成及其產(chǎn)生的細(xì)胞損傷都會(huì)導(dǎo)致AD患者腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高。氧化應(yīng)激增加時(shí)，出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊功能受損，同時(shí)還出現(xiàn)自吞噬介導(dǎo)和蛋白酶體介導(dǎo)的受損蛋白質(zhì)的清除缺陷，這些加速AD中淀粉樣肽和tau蛋白的聚集[5]?；钚苑磻?yīng)組分會(huì)造成細(xì)胞膜脂質(zhì)被破壞、DNA裂解、蛋白氧化，最后引起細(xì)胞凋亡[6]。在本研究中，10 μg/mL Aβ1-42處理24 h后產(chǎn)生細(xì)胞毒性，導(dǎo)致SK-N-SH細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，這進(jìn)一步證實(shí)了Aβ可引發(fā)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量自由基，最后誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生衰老及凋亡。本研究采用的Aβ濃度要遠(yuǎn)高于生理濃度，此時(shí)可溶的Aβ會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，形成β片層樣結(jié)構(gòu)[7]，這個(gè)狀態(tài)下的Aβ易發(fā)生纖維聚積，并誘導(dǎo)更多的Aβ片段發(fā)生錯(cuò)誤折疊[8]。Aβ濃度過(guò)高、發(fā)生β折疊及纖維形成正是Aβ具有神經(jīng)毒性作用的基礎(chǔ)。

圖3 檢驗(yàn)siRNA的干擾效果 A1:western blot檢測(cè)hTERT蛋白表達(dá)；A2:對(duì)western blot(A1)的定量分析；B:實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)hTERT mRNA表達(dá). 1：Control；2：trasfection reagent control;3:negative control;4:1797組;5:2919組;6:3042組. 與對(duì)照組比較，*：P<0.01；與對(duì)照組比較，**：P<0.001

圖4 細(xì)胞經(jīng)過(guò)siRNA干擾后，MTT檢測(cè)姜黃素對(duì)SK-N-SH細(xì)胞存活率的影響 1：Control；2：2919組；3:Aβ42組；4:2019+Aβ42組;5:2019+Aβ42+curcumin組.與對(duì)照組比較，*：P<0.001；與2919組比較，#：P<0.001；與Aβ42組比較，Δ：P<0.001

人端粒酶包含3個(gè)亞單位，分別是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)、端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)以及角化不良蛋白(dyskerin，DKC1)[9]。hTERT可用單鏈RNA為模板復(fù)制出單鏈DNA。某些早老綜合征的研究中可發(fā)現(xiàn)較短的端粒[10]，一些研究表明基于端粒酶的治療策略在對(duì)于抗衰老的治療中起重要作用。早前的體外研究發(fā)現(xiàn)低濃度的Aβ可明顯地抑制端粒酶的活性[11]，用Aβ及反義核苷酸技術(shù)抑制PC12細(xì)胞中TERT的表達(dá)后，未分化的PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡率明顯超過(guò)對(duì)照組，端粒酶受體受到Aβ抑制的細(xì)胞的凋亡也明顯加速[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Aβ1-42處理SK-N-SH細(xì)胞后，實(shí)時(shí)定量PCR及蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)hTERT的表達(dá)明顯減少。結(jié)果進(jìn)一步表明SK-N-SH細(xì)胞的活性發(fā)生改變很有可能是由于Aβ1-42抑制hTERT的表達(dá)所致，此時(shí)細(xì)胞的端粒酶活性下降，Aβ誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡的毒性作用明顯增強(qiáng)。

姜黃素被證實(shí)具有廣泛的藥理學(xué)活性， 在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中已經(jīng)有數(shù)千年的應(yīng)用歷史，已逐漸成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)[13]。姜黃素具有獨(dú)特的抗氧化活性，并通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平改善淀粉樣病變，這主要是通過(guò)刺激轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的表達(dá)[14]，抑制MAP激酶信號(hào)以及影響細(xì)胞分裂周期來(lái)對(duì)抗氧化的谷氨酸毒性[15]，從而抑制氧化應(yīng)激對(duì)AD腦中Aβ所誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的影響。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL姜黃素能明顯改善細(xì)胞存活率，保護(hù)SK-N-SH細(xì)胞免受Aβ1-42的損傷。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，姜黃素預(yù)處理細(xì)胞還可對(duì)抗Aβ1-42損傷而上調(diào)hTERT的表達(dá)，免疫熒光結(jié)果顯示SK-N-SH細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞形態(tài)也得以明顯改善。這有悖于之前一些關(guān)于癌癥的研究[16-17]得出的結(jié)論，這些研究發(fā)現(xiàn)姜黃素會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性而促使腫瘤細(xì)胞凋亡，然而本研究卻發(fā)現(xiàn)姜黃素非但沒(méi)有抑制端粒酶的活性，而且還能上調(diào)hTERT的表達(dá)，使端粒酶活性增加。因此，在仔細(xì)研讀了這些關(guān)于姜黃素治療癌癥的相關(guān)文獻(xiàn)后，發(fā)現(xiàn)這些研究中所采用的姜黃素濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本研究采用的濃度，猜測(cè)姜黃素的劑量可能是造成本研究結(jié)果與那些研究存在差異的根本原因，另外還有一個(gè)可以用來(lái)解釋矛盾的原因就是用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞類型有所不同。

然而，端粒酶的活性被TERT小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾以后，端粒酶活性喪失，姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用也隨之消失，不再具有改善細(xì)胞存活率以及抗氧化應(yīng)激的作用。由此推測(cè)姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用很有可能是建立在端粒酶具有活性的前提之下的，換而言之，端粒酶很可能是姜黃素治療Aβ?lián)p傷的靶點(diǎn)之一。端粒酶及TERT在AD模型中可以增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞對(duì)包括Aβ在內(nèi)的細(xì)胞毒性物質(zhì)損傷的抵抗，姜黃素有可能是通過(guò)增加hTERT表達(dá)，增加端粒酶的活性，使端粒延長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂且抑制細(xì)胞產(chǎn)生衰老或凋亡，從而保護(hù)細(xì)胞免受Aβ?lián)p傷。

總之，本研究結(jié)果表明Aβ可促使SK-N-SH細(xì)胞凋亡、抑制hTERT表達(dá)，姜黃素具備對(duì)抗Aβ1-42神經(jīng)毒性的作用，能抑制Aβ1-42誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老及細(xì)胞凋亡，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及功能均有保護(hù)作用。鑒于姜黃素具有特異性結(jié)合Aβ、易穿過(guò)血腦屏障[18]以及中藥低毒性等一些天然優(yōu)勢(shì)，因而有理由相信姜黃素在治療AD方面有十分廣闊的應(yīng)用前景。RNA干擾后SK-N-SH細(xì)胞上的端粒酶失去活性，姜黃素對(duì)抗Aβ毒性的細(xì)胞保護(hù)作用隨之消失，提示姜黃素的神經(jīng)保護(hù)作用可能是建立在端粒酶活性的基礎(chǔ)上的，端粒酶可能是姜黃素治療Aβ?lián)p傷的靶點(diǎn)。若能明確端粒酶的特性及其活化條件，重建hTERT及端粒酶活性，延緩細(xì)胞衰老，抵抗細(xì)胞凋亡，或許能為AD的防治提供更好更有效的方法。

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Telomerase:aTargetforTherapeuticEffectsofCurcuminandaCurcuminDerivativeinAβInsultinvitro

XIAO Zijian,XIE Ming,ZHOU Guijuan,et al

(DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate whether telomerase was involved in the neuroprotective effect of curcumin against Aβ.MethodsAβ1-42 (10 μg/mL) was used to establish a damaged cell model and curcumin (10 μg/mL) was used in treatment groups.Cell survival and cell growth,intracellular oxidative stress and hTERT expression was measured.After RNA interference,the effects of curcumin on cells were verified.ResultsExposure to Aβ1-42 resulted in significant oxidative stress and cell toxicity,and the expression of hTERT was significantly decreased (P<0.001).Curcumin protected SK-N-SH cells from Aβ1-42 and up-regulated the expression of hTERT (P<0.001).However,when telomerase activity was inhibited by TERT siRNA,the neuroprotection by curcumin was whittled (P>0.05).ConclusionThe neuroprotective effect of curcumin against Aβ depends on telomerase activity,and thus telomerase may be a target for therapeutic effect of curcumin.

amyloid-beta; curcumin; telomerase; human telomerase reverse transcriptase

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.005

2015-07-26；

2015-10-13

*通訊作者，E-mail：634029592@qq.com.

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(此文編輯：朱雯霞)