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(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科)

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)·

胃癌患者血清miR-20a的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

楊瑞瑞1，向夢(mèng)琴1，周秀田1，扶云1，徐海帆2，陳卓2，游琴1，王佩華1，曾敏1，徐迎暉1，曾希1*

(1.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科)

目的探討胃癌初診患者血清miR-20a的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法采集45例原發(fā)胃癌初診患者血清，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)，加入cel-miR-39作為數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化指標(biāo)，檢測(cè)血清miR-20a的表達(dá)量。結(jié)果胃癌患者血清中miR-20a表達(dá)與胃癌分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。低分化組血清miR-20a表達(dá)水平明顯高于中分化組和高分化組。miR-20a在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者血清中的表達(dá)水平明顯高于Ⅰ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。miR-20a的表達(dá)與患者的性別、年齡無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論胃癌患者血清miR-20a表達(dá)與胃癌分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可能用于胃癌早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。

胃癌； 血清標(biāo)志物； miR-20a； 實(shí)時(shí)定量PCR

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)最新數(shù)據(jù)顯示，全球每年胃癌新發(fā)病例為10萬(wàn)例，占所有癌癥新發(fā)病例的8.9%，僅次于肺癌、乳腺癌和結(jié)、直腸癌。每年因胃癌而死亡的病例為75萬(wàn)例，占癌癥相關(guān)死亡的9.7%，僅次于肺癌。而全球有將近50%的胃癌診斷來(lái)源于中國(guó)，且胃癌發(fā)病年齡逐漸趨于年輕化[1]。因胃癌早期無(wú)明顯癥狀，就診時(shí)80%患者已處于中晚期，治療效果及預(yù)后差，5年生存率極低。由于傳統(tǒng)的胃鏡檢查不易普及，并且部分患者不適宜行該項(xiàng)檢查。因此，尋找新型的非侵入性的且具有較高敏感性和特異性的胃癌早期診斷分子標(biāo)志物是目前亟待解決的難題。循環(huán)miRNA作為腫瘤無(wú)創(chuàng)診斷分子標(biāo)志物的研究已成為腫瘤早期診斷研究中一個(gè)非常重要的研究方向[2]，近幾年來(lái)研究者們發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA在許多腫瘤中扮演著類似癌基因或抑癌基因的角色，并已表明循環(huán)miRNA具有成為新型腫瘤分子標(biāo)志物的最佳條件[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-20a與人類腫瘤關(guān)系密切，在宮頸癌、前列腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)顯著上調(diào)，并和腫瘤的生長(zhǎng)、遷移侵襲、浸潤(rùn)及預(yù)后相關(guān)[5-8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-20a在胃癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)均上調(diào)，其高表達(dá)可以增強(qiáng)胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。本課題組在之前的研究中建立了一定規(guī)模的腫瘤血清樣本庫(kù)，并在不斷完善[10]。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)胃癌初診患者血清中miR-20a表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合患者的臨床病理特征，分析miR-20a表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征之間的關(guān)系，探討血清miR-20a在胃癌診斷和病情監(jiān)測(cè)中的意義。

1 材料與方法

1.1血液樣本的收集及血清總RNA的提取選擇南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床診斷的原發(fā)胃癌患者，征得患者同意，在治療前采集清晨空腹靜脈全血4 mL至血清采集管中，室溫下靜置1 h后離心 (4 ℃，1 200 g，10 min)。為進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片，離心后將上層血清移至一個(gè)新的EP管，再次進(jìn)行離心(4 ℃，12 000 g，5 min)。然后使用miRNeasy Serum/Plasma Kit 試劑盒(QIAGEN)，按說(shuō)明書步驟提取血清總RNA，于-80 ℃保存?zhèn)溆?。所有患者?jīng)術(shù)后病理診斷確診為原發(fā)胃癌。胃癌臨床分期采用AJCC第七版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)[11]。

1.2逆轉(zhuǎn)錄以20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，采用qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miScript Ⅱ RT Kit(QIAGEN)轉(zhuǎn)錄血清總RNA為cDNA，操作步驟及注意事項(xiàng)嚴(yán)格按照miScript Ⅱ RT Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。反應(yīng)條件為：37 ℃，60 min，充分活化試劑中的逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄；95 ℃，5 min，抑制逆轉(zhuǎn)錄酶作用。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)體系在冰上放置5～10 min。然后加入200 μL無(wú)酶水到逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行稀釋，充分混合。將cDNA進(jìn)行分裝，避免反復(fù)凍融和污染，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 由于血清miRNA的檢測(cè)尚無(wú)公認(rèn)可靠的內(nèi)參，本課題采用加入外源性cel-miR-39作為內(nèi)參[12]。使用相對(duì)定量法來(lái)測(cè)定miR-20a在胃癌患者手術(shù)前后的表達(dá)差異。miR-20a引物序列如下，F(xiàn)：5′- UAA AGU GCU UAU AGU GCA GGU AG-3′,R:5′- GCT AAA GTG CTT ATA GTG CAG GT-3′。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用的是miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒(QIAGEN)，總反應(yīng)體系為10 μL，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix為5 μL，10×miScript Universal Primer 量為1 μL，10×miScript Primer Assay 1 μL，RNase-free water 2 μL，Template cDNA 1 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃，15 min；94 ℃，15 s，55 ℃，30 s，70 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，內(nèi)參及待測(cè)miRNA分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)添加溶解曲線，溫度從55～95 ℃，在溫度逐漸攀升的過(guò)程中對(duì)熒光強(qiáng)度的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)的檢測(cè)，使用美國(guó)illumina公司Eco熒光定量PCR儀檢測(cè)。

1.4數(shù)據(jù)篩選和統(tǒng)計(jì)分析采用Illumina Eco熒光定量PCR系統(tǒng)配套軟件對(duì)采集的原始熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。每一次檢測(cè)都加入等量外源性C.elegans miR-39(cel-miR-39)作為數(shù)據(jù)歸一化標(biāo)準(zhǔn)。為了使結(jié)果更加真實(shí)可靠，每一個(gè)樣本相對(duì)應(yīng)的miRNA均進(jìn)行了三次PCR擴(kuò)增，對(duì)所得的三個(gè)復(fù)孔的Ct值取算數(shù)平均值即為該miRNA擴(kuò)增的最終Ct值，計(jì)算出△Ct(△Ct=CtmiR-20a-Ctcel-miR-39)，根據(jù)△Ct值相對(duì)定量，比較分析目的miR-20a在不同胃癌患者血清中的表達(dá)水平，采用相對(duì)表達(dá)量(Relative expression)表示[13]。

采用SPSS 18.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組比較采用t檢驗(yàn)，3組或以上比較用單因素方差分析。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)血清miR-20a表達(dá)的可靠性分析通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)胃癌初診患者血清中miR-20a的表達(dá)。圖1顯示：實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線標(biāo)準(zhǔn)、平臺(tái)期前呈指數(shù)增長(zhǎng)，提示擴(kuò)增效率理想。溶解曲線存在陡峭變化段、只存在一個(gè)溶解峰、無(wú)肩峰、且溶解峰在同一位置，提示miR-20a引物特異性好、不形成引物二聚體、擴(kuò)增有高度特異性，能正確地檢測(cè)胃癌患者血清中miR-20a的表達(dá)。

2.2血清miR-20a表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系以胃癌患者血清中miR-20a表達(dá)值的中位數(shù)(median value=0.135)為臨界值將其分為低表達(dá)組和高表達(dá)組[13-14]，miR-20a的表達(dá)值小于0.135為低表達(dá)，大于等于0.135則為高表達(dá)。結(jié)果顯示miR-20a在45例胃癌患者血清中有22例低表達(dá)(48.9%)，23例高表達(dá)(51.1%)。采用軟件分析發(fā)現(xiàn)胃癌患者血清miR-20a的表達(dá)與患者性別、年齡(60歲為界)、腫瘤大小(3 cm為界)無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)；然而，單因素方差分析顯示血清miR-20a的表達(dá)受腫瘤分化程度和患者臨床分期的影響(P<0.05)。此外，低分化組血清miR-20a的表達(dá)明顯高于中分化組及高分化組(P<0.05)，并且在臨床分期中Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期血清miR-20a的表達(dá)水平顯著高于I期(P<0.05)；同時(shí)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的胃癌患者中血清miR-20a的表達(dá)要明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)。以上結(jié)果提示，miR-20a在胃癌血清中表達(dá)與其分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(表1，圖2)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè)12例患者血清中mi-20a表達(dá)的擴(kuò)增情況. 左為擴(kuò)增曲線，中、右為溶解曲線

表1胃癌血清miR-20a的表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n=45)

指標(biāo)例數(shù)miR?20a低表達(dá)高表達(dá)P值性別0．258 男271413 女18810年齡(歲) ≥602612140．322 <6019109分化程度0．001 低分化22814 中分化1468 高分化981臨床分期 Ⅰ151140．000 Ⅱ1138 Ⅲ1037 Ⅳ954淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有269170．000 無(wú)19136腫瘤大小 ≥3cm2712150．090 <3cm18108

3 討 論

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，血清或血漿中存在miRNA(循環(huán)miRNA)，這些miRNA在復(fù)雜的血液環(huán)境中能穩(wěn)定存在，不被RNases降解，在室溫下較長(zhǎng)時(shí)間放置和反復(fù)的凍融后，其中的miRNA量無(wú)明顯變化，并且還能耐受酸堿環(huán)境[15]。此外，不同健康個(gè)體的循環(huán)miRNA表達(dá)總體水平相當(dāng)一致，沒(méi)有明顯個(gè)體差異，而疾病能明顯影響循環(huán)中miRNA的表達(dá)，使其具有良好的重復(fù)性和可比性[16]。由于其極高的理化穩(wěn)定性和疾病相關(guān)性，血清或血漿miRNA作為疾病標(biāo)志物的研究廣泛興起，特別是在腫瘤性疾病中。早在2008年Lawrie等人就發(fā)現(xiàn)在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤病人血液循環(huán)中miR-155、miR-210、miR-21表達(dá)明顯上調(diào)，并且miR-21的表達(dá)與患者無(wú)復(fù)發(fā)生存明顯相關(guān)[17]。最近Antolin等[18]人用qRT-PCR檢測(cè)了57例乳腺癌患者和20例健康人群血清，發(fā)現(xiàn)miR-200c和miR-141在乳腺癌患者血清中表達(dá)明顯失調(diào)，且與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，可以作為判斷預(yù)后的獨(dú)立因子。Fang等[19]研究表明血漿miR-24、miR-320a、miR-423-5p在結(jié)直腸癌患者循環(huán)血中明顯下調(diào)，且早期診斷敏感性較高，可用于結(jié)直腸癌患者早期診斷的標(biāo)志物。綜上所述，這些研究表明循環(huán)miRNA很有潛力成為腫瘤早期診斷、預(yù)后判斷或復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)的分子標(biāo)志物。

然而，由于研究時(shí)間不長(zhǎng)，循環(huán)miRNA的研究也存在一些問(wèn)題。由于目前循環(huán)miRNA研究無(wú)公認(rèn)可靠的內(nèi)參，本研究中采取目前公認(rèn)的加入外源性內(nèi)參的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。此外，血清中miRNA含量相對(duì)組織和細(xì)胞中miRNA低得多，而且提取相對(duì)困難。本研究采用專為提取血清和血漿中miRNA開發(fā)的商品化試劑盒提取胃癌患者血清中miRNA。擴(kuò)增曲線和溶解曲線證實(shí)提取miRNA質(zhì)量理想，擴(kuò)增特異性高，結(jié)果可靠。

圖2 45例胃癌患者血清miR-20a在不同分組中的表達(dá)分布情況

qRT-PCR是目前檢測(cè)miRNA最理想的方法。本研究采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)胃癌患者血清中miR-20a進(jìn)行檢測(cè)并結(jié)合臨床病理特征參數(shù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-20a的表達(dá)與患者的年齡、性別及腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)性，而與胃癌的分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示血清miR-20a水平可反映胃癌患者的病情進(jìn)展情況，可能用于胃癌患者的病情監(jiān)測(cè)。此外，在臨床分期中，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌患者血清miR-20a的表達(dá)水平顯著高于I期。Wang等[14]在胃癌患者血漿中的研究也得到了類似的結(jié)果。這些研究表明血清miR-20a的改變是胃癌發(fā)生的早期事件，可能用于胃癌早期診斷，并有望成為胃癌早期診斷的分子標(biāo)志物。本文為血清miR-20a用于胃癌的監(jiān)測(cè)與診斷提供了良好的啟示和一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其效率如何、最終能否應(yīng)用于臨床仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

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RelationshipBetweenSerummiR-20aExpressionandClinicopathologicalFeaturesinGastricCancer

YANG Ruirui,XIANG Mengqin,ZHOU Xiutian,et al

(CancerResearchInstitute,UniversityofSouthernChina,Hengyang,Hunan421001,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between serum miR-20a expression and clinicopathological features in gastric cancer.MethodsSerum was collected in 45 primary gastric cancer patients who were untreated.Real-time quantitative PCR was adopted to detect the expression of miR-20a in serum using C.elegans miR-39 as an internal reference gene.ResultsIn this case,we analyzed the relationship between the serum miR-20a expression level and clinicopathological features.The results showed that expression of miR-20a was related with tumor differentiation,TNM stages and lymph node metastasis (P<0.05).The expression level of serum miR-20a was significantly higher in poorly differentiated gastric cancer patients than that in moderately differentiated and well differentiated gastric cancer patients.Moreover,miR-20a level was significantly higher in stage Ⅱ，Ⅲ and Ⅲ than stage Ⅰ,also higher in lymph node metastasis group than those patients without lymph node metastasis.ConclusionThe expression level of miR-20a is related with tumor differentiation,TNM stages and lymph node metastasis.MiR-20a is a candidate biomarker for detecting and monitoring gastric cancer.

gastric cancer；serum biomarker；miR-20a；qRT-PCR

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.06.001

2015-09-14；

2015-10-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101643)資助.

*通訊作者，E-mail：zx397@126.com.

R735.2

A

(此文編輯：蔣湘蓮)