楊彤暉，孟鎮(zhèn)，鐘其頂，仇凱，安麗艷，李志軍

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(全國食品發(fā)酵標準化中心，北京，100015)

近年來，肉制品的摻假事件層出不迭，其中尤以低值肉類摻入冒充高值肉類最為嚴重。肉制品的真實性鑒別已經成為行業(yè)內關注的熱點問題之一。目前，動物源性成分鑒別方法主要有蛋白質鑒別［酶聯免疫吸附(ELISA)，等電聚焦(IEF)，高效液相色譜(HPLC)等］［1-3］和分子學鑒別［聚合酶鏈式反應(PCR)，DNA 雜交等］［4-5］等。由于 DNA 較蛋白質而言耐熱性強，不依賴于組織和細胞的類型，具有更高的種間多態(tài)性等優(yōu)點，基于以物種間基因差異為基礎的分子生物學鑒別方法已成為食品中動物源成分鑒別的主要方法［6］。

對于深加工肉制品，如罐頭制品、肉干、肉骨粉等，由于經過了繁雜的前處理和長時間的高溫加工，使得DNA嚴重降解［7］。從這些深加工食品中提取足夠數量和質量的DNA是進行動物源分子學鑒別的基礎和關鍵。

目前，常用的DNA提取方法有SDS法，異硫氰酸胍法，CTAB法和試劑盒法［8］。本研究比較了EE101-02 DNA提取試劑盒、SDS法、CTAB法和異硫氰酸胍法對豬肉罐頭食品DNA的提取效果，并指出了適用于分子生物學研究的豬肉類罐頭食品中總DNA提取的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

7種豬肉類罐頭食品(表1)，從超市購買的鮮豬肉樣品作為陽性對照。

表1 豬肉類罐頭樣品Table 1 Canned pork samples

1.1.2 試劑

EE101-02 DNA提取試劑盒(easyPure genomic DNA提取試劑盒型，型號EE101-02，北京全式金生物技術有限公司);異硫氰酸胍法裂解液［5 mol/L GuSCN，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，1.3%Triton-X 100，0.02 mol/L EDTA(pH 8.0)］;CTAB 法裂解液［1%CTAB，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.7 mol/L NaCl，0.01 mol/L EDTA(pH 8.0)］;SDS 法裂解液［1%SDS，0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0)，0.1 mol/L EDTA(pH 8.0)］;蛋白酶 K(20 mg/mL);V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1;TE 緩沖液(0.01 mol/L Tris，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0);異丙醇;無水乙醇。

1.2 儀器與設備

3K15型高速冷凍離心機(德國Sigma公司);Tgradient PCR擴增儀(德國Biometra公司);DYY-8C型高壓電泳儀(北京六一儀器廠);CV-1000型凝膠成像系統(tǒng)(法國VILBER LOURMAT公司)。

1.3 DNA提取方法

1.3.1 樣品前處理

分別取2g鮮豬肉和豬肉類罐頭樣品于10 mL離心管中，加入6 mL的無菌去離子水，上下顛倒充分混勻，9 000 g室溫離心5 min并棄去上清液。再加入6 mL的三氯甲烷，9 000 g室溫離心5 min并棄去上清液。然后再用無菌去離子水清洗樣品1次。

1.3.2 EE101-02 DNA提取試劑盒提取DNA

按照試劑盒說明書操作進行。

1.3.3 異硫氰酸胍法

參考邵碧英［9］，何建文［10］的研究，并進行適當修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入200 μL TE，混勻;加入 400 μL裂解液，室溫放置30 min后，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，混勻;10 000 g室溫離心5 min，取上清液，加0.8倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h;10 000 g室溫離心5 min，棄上清液;體積分數70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.3.4 CTAB法

參考 GB/T 21101-2007［11］，并進行適當修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入600 μL CTAB裂解液，65℃ 溫育30 min，每隔10 min振蕩混勻1次;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至新離心管中，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，充分混勻;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至一新離心管中，加0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀1h;10 000 g室溫離心10 min，棄上清液;70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.3.5 SDS法

參考Kitano T的研究［12］，并進行適當修改。稱取50 mg樣品于1.5 mL離心管中，加入600 μL裂解液，并加入20 μL 5 mg/mL蛋白酶 K;55℃12 h水浴;在冰上放置30 min，10 000 g室溫離心10 min;轉移上清液至一新離心管中，加400 μL V(三氯甲烷)∶V(異戊醇)=24∶1溶液，充分混勻;10 000 g室溫離心5 min，吸取上清液至一新離心管中，加0.8倍體積異丙醇，室溫下沉淀1h;10 000 g室溫離心10 min，棄上清液;70%乙醇洗滌1次，晾干;加入50 μL TE緩沖液，溶解沉淀。

1.4 PCR檢測

以4種方法提取的總 DNA為模板，參考文獻［13-15］，根據豬線粒體基因組(mtDNA)細胞色素b(Cytochrome b，Cyt b)基因和16S rRNA基因，選取通用引物(表2)進行PCR反應。每組反應做2個平行試驗。PCR反應采用25 μL體系:10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，20pmol/uL 引物各1 μL，模板 DNA 2 μL，Taq DNA Polymerase 0.3 μL(1.5U)，MgSO4(50 mmol/L)1 μL，ddH2O 補足體積。擴增條件為:94℃ 3 min，94℃ 30s，相應退火溫度(表2)30s，72 ℃ 30s，35 個循環(huán)，72 ℃ 5 min。擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 通用引物序列及擴增產物大小Table 2 The sequences and products size of universal primers

2 結果與分析

使用表2中3對引物對4種方法提取的DNA進行PCR擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖1～圖3所示。

從圖1、圖2可以看出，對于鮮豬肉和7種罐頭樣品，異硫氰酸胍法提取的DNA，均能利用引物擴增出244 bp和376 bp的片段，且條帶整齊明亮。相比較，EE101-02 DNA提取試劑盒提取的DNA，只有部分罐頭樣品的DNA可以利用引物擴增出目的片段，且條帶暗淡微弱。對于CTAB法和SDS法提取的DNA，有少數罐頭樣品的DNA不能利用引物擴增出244 bp和376 bp的目的片段。

圖1 使用引物L2513/H2714(244 bp)擴增4種方法提取DNA結果Fig.1 Amplification results of primer L2513/H2714(244 bp)

圖2 使用引物L14181/H15149(376 bp)擴增4種方法提取DNA結果Fig.2 Amplification results of primer L14181/H15149(376 bp)

從圖3可以看出，對于4種方法提取7種豬肉類罐頭的DNA，利用引物mcb398/mcb869進行PCR擴增，大部分樣品電泳未見大小為472 bp的目的片段。而對于鮮豬肉，4種方法提取的DNA均能擴增出目的片段。這是由于罐頭加工過程中，高溫高壓使DNA斷裂、降解，不易擴增到大片段基因。但是對于云腿大片罐頭，CTAB法、SDS法和異硫氰酸胍法提取的DNA均可以擴增出472 bp的目的片段，這是因為云腿大片罐頭的殺菌條件是95℃下加熱100 min［16］，較低的殺菌溫度減少了DNA的破壞。

圖3 使用引物mcb398/mcb869(472 bp)擴增4種方法提取DNA結果Fig.3 Amplification results of primer mcb398/mcb869(472 bp)

表3匯總了不同方法提取樣品DNA的PCR擴增結果?？梢钥闯觯瑢τ谕粯悠?，不同方法提取DNA的效果差異明顯。

表3 四種方法提取各樣品總DNA PCR情況匯總Table 3 Amplification results of the total DNA extracted by four methods

表4列出了4種方法提取DNA的原理及其操作所需時間。綜上，對于豬肉類罐頭產品，異硫氰酸胍法提取DNA的質量最好，可以滿足后續(xù)PCR試驗的要求，且操作簡便，花費時間短。

表4 四種方法提取DNA的原理及操作時間Table 4 The principle and time of four DNA extraction methods

對以上樣品利用L14181/H15149擴增其Cyt b部分序列，擴增PCR產物送至上海生工生物公司進行測序。將測序結果與Genbank中參考序列比對，結果顯示7種罐頭樣品與豬(Sus scrofa)(GenBank登錄號:NC_000845.1)的相似度為98%。表明所用7種豬肉類罐頭含有豬源性成分。

3 討論

提取質量合格的DNA是利用分子生物學方法鑒別肉制品動物源成分的第一步，也是關鍵的一步。特別是對于肉類罐頭食品，由于加工過程中添加了調味料，并經過長時間的高溫高壓殺菌過程，其DNA破壞程度要比一般加工食品更為嚴重［7，17-18］。動物細胞中，每個細胞中有數百個線粒體，每個線粒體包含多份拷貝的DNA，在數量上遠超核DNA，另外，線粒體DNA長度遠短于核DNA，這些特點使線粒體DNA適用于加工食品的分析［19］。本研究中，從所選7種豬肉類罐頭產品中都可以擴增出最高376 bp的線粒體基因片段，但是當目的片段增大到472 bp時，只有3種罐頭樣品可以擴增出目的片段。

在DNA提取過程中，目前應用最多的DNA提純方法仍然是傳統(tǒng)的酚三氯甲烷抽提法，主要是利用苯酚使蛋白質變性，使蛋白質溶于酚相，DNA溶于水相。但是使用苯酚有非常大的缺點。苯酚屬高毒類，對皮膚和黏膜有強烈的腐蝕性，能經皮膚和黏膜吸收而造成中毒。而且由于實驗使用的苯酚為商品酚，易被氧化產生醌、二酸，可破壞核酸的二酯鍵，并引起DNA鏈的交聯［20］。在本試驗中，DNA的純化舍棄苯酚，直接采用三氯甲烷異戊醇體系，減少了操作時間，并降低了試驗給操作人員帶來的安全風險。試驗結果表明，使用三氯甲烷異戊醇體系仍可以從豬肉類罐頭這種深加工食品中提純合格質量的DNA。

4 結論

為了能在DNA受損嚴重的罐頭食品中提取到片段較大、質量較好的DNA，使用PCR片段大小梯度擴增手段對4種方法的提取DNA效果進行比較。試驗結果顯示，異硫氰酸胍法在4種方法中提取DNA的效果最好，且操作簡便，不需要水浴，提取時間短，成本低廉，可以滿足后續(xù)PCR試驗的要求。

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