孫謙，胡中海，孫志高，蓋智星，黃巧娟，郝靜梅

1(西南大學 柑桔研究所，重慶，400712)2(中國農(nóng)業(yè)科學院，柑桔研究所，重慶，400712)

柑橘種子作為柑橘加工的副產(chǎn)物不僅可以用于栽培種子，更有藥用價值。橘核味苦、平，具有理氣、散結、止痛等功效，常用于治療小腸疝氣、睪丸腫痛、乳癰腫痛等癥［1］。據(jù)研究報道柑橘種子含油量達38.9% ～58.5%［2-3］，高于棉籽(18% ～22%)、大豆(18% ～25%)和橄欖(20.0% ～25.0%)［4］等種子油脂含量;同時柑橘種子油還含有大量的檸檬苦素、黃酮、VE、植物甾醇等，是一種具有保健功能的油脂來源［3，5-6］。目前油脂萃取的主要方法有超臨界CO2流體萃取、溶劑萃取、壓榨和水酶法等，但不同的萃取方法對柑橘種子油脂品質的影響卻鮮有報道。長葉橙是20世紀70年代中期，由重慶市果樹工作者在江津甜橙中選育出的一個地方良種。它具有皮薄、油胞細、汁多、肉味獨特，且種子含量豐富等特點，既可鮮食也可加工［7］。本文以長葉橙種子為實驗原料，采用超臨界CO2流體萃取、超聲波輔助溶劑萃取、壓榨機冷榨和熱榨四種方法萃取長葉橙種子油，測定該油脂的初始理化性質、脂肪酸組成、檸檬苦素含量以及自氧化能力等指標，對比分析不同的萃取方法對長葉橙種子油品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長葉橙種子，重慶江津;CO2氣體(純度 ＞99.5%)，重慶北碚光明氣體廠;14%三氟化硼-甲醇溶液 CNW 公司;乙腈(色譜純)SIGMAALDRICH.CO;無水 Na2SO4、KOH、正己烷、乙醚、無水乙醇、ICl、KI，以上溶劑均為分析純，購于重慶川東化工有限公司化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

HA221-50-06-C型超臨界CO2萃取儀，華安超臨界萃取有限公司;TM-RA303家用榨油機，佛山市南海TCL家用電器有限公司;B-480旋轉蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司;UltiMateTM3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;Unicen MR臺式高速冷凍離心機，德國Herolab公司;GZX-9240 MBE數(shù)顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;DP-800超聲波清洗器，上海生析超聲儀器有限公司;THD-1020低溫恒溫槽，寧波天恒儀器廠;BCD-254(KK24V45TI)雙開門冰箱，博西華家用電器有限公司;6202高速粉粹機，北京燕山正德機械設備有限公司;BT 224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 粗脂肪含量及各方法油脂提取率

參照GB/T 5512-2008糧油檢驗糧食中粗脂肪含量測定。

超臨界CO2流體萃取(SCF-CO2)最佳工藝參數(shù):萃取壓力27 MPa;萃取溫度46℃;CO2流量33 L/h;萃取時間2.3 h。

超聲波輔助溶劑萃取(UAS)工藝參數(shù):萃取溶劑正己烷;超聲功率300 W;超聲時間2 h;料液比1∶8;超聲溫度40℃。

冷榨(CP)/熱榨(HP)使用榨油機，參數(shù)設置為:油料，葵花籽;工藝，冷榨(熱榨);香型，清香型。熱榨需榨油機自動炒料40 min。所得油脂，置于離心管，以4 500 r/min的轉速離心10 min去除雜質，計算油脂萃取率:

萃取率/%=m/m1

式中:m為不同方法萃取的油脂質量;m1為粗脂肪質量。

1.3.2 理化指標的測定

相對密度測定:GB/T 5518-2008糧油檢驗 糧食、油料相對密度的測定;折光率測定:GB/T 5527-2010動植物油脂，折光指數(shù)的測定;酸值測定:GB/T 5530-2005動植物油脂 酸值和酸度測定;非皂化值測定:GB/T 5535.2-2008動植物油脂不皂化物測定己烷提取法;碘值測定:GB/T 5532-2008動植物油脂碘值的測定;過氧化值:GB/T 5538-2005動植物油脂過氧化值測定。

1.3.3 檸檬苦素類物質分析

參照郭燁［8］的方法，采用高效液相色譜儀(HPLC)測定。稱取長葉橙種子油1 g，精確至小數(shù)點后2位。以乙腈定容至10 mL容量瓶，混勻，靜止30 min，用0.45 μm濾膜過濾，上樣。色譜條件:色譜柱:MP C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5μm);柱溫30℃;檢測波長:210 nm;檢測器:紫外檢測器;流動相∶V(乙腈)∶V(水)=38∶62;進樣量:20 μL;流速:1 mL/min。

1.3.4 脂肪酸組成分析

參考 Dias［9］和 AOAC［10］的方法，稱取 0.5 g 油脂于15 mL具塞試管中，加入3 mL苯石油醚混合溶劑(體積比1∶1)，輕輕搖動使之溶解。再加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，混勻。在45℃水浴中反應30 min。加1 mL正己烷使甲酯溶于其中，最后加適量飽和NaCl溶液使全部有機相甲酯溶液上升至試管上部。澄清后吸取上清液，裝入進樣小瓶中，即可用于氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)分析。脂肪酸的定性采用MS譜庫相似度檢索定性，定量采用峰面積歸一化法。

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀參數(shù):DB-FFAP毛細管色譜柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)，壓力 100.1 kPa，總流量87.3 mL/min，柱流量1.04 mL/min，線速度38.9 cm/s，吹掃流量3.0 mL/min，不分流，進樣量1 μL，載氣為氦氣，進樣口溫度250℃，柱溫升溫程序為:起始溫度60℃，保持2 min，以12℃/min升到160℃，保持2 min，以3℃/min升到230℃，保持3 min，總程序時間37.5 min。

1.3.5 貯藏能力測定

采用Schaal烘箱法［11-12］將4種方法提取的長葉橙種子油30 mL置于50 mL燒杯中，敞口放入(60±1)℃的恒溫箱中，每隔48h取油樣分析，測定其過氧化值(POV)、酸值(AV)。

2 結果與分析

2.1 粗脂肪含量及各方法油脂提取率

經(jīng)索氏抽提法，回流8h測得長葉橙種子含油量為33.80%，表1為4種萃取方法的油脂提取率。由表可知采用超臨界CO2流體萃取油脂其提取率最高，冷榨法的油脂提取率最低。

表1 不同方法的油脂萃取率 %Table 1 Oil extraction rate of different methods%

表2 不同方法萃取油脂初始理化指標Table 2 Initial physical and chemical indicators of oil extracted by different methods

2.2 初始指標測定結果

實驗結果表明，4種方法所萃取的油脂折光率及相對密度不存在明顯差異(P＜0.05)，折光率與20℃條件下花生油(1.471 61)、菜籽油(1.472 87)接近［13］。4種方法所得油脂酸值均小于 4(KOH)/(mg/g)，過氧化值均小于24 mmol/kg，符合食用植物油衛(wèi)生標準對植物原油的指標要求［14］。其中采用超臨界CO2萃取所得油脂的酸價明顯高于其他3種方法(P ＜0.05)，趙云霞等［15］也發(fā)現(xiàn)，超臨界 CO2流體所萃取的山杏油的酸值高于冷榨，可能是CO2溶解于油脂中所致。4種方法萃取油脂的碘值均小于100，與橄欖油、茶油、花生油、椰子油、棕櫚油、桕脂和大多數(shù)動物油脂一樣屬于不干性油脂，這類油脂的主要用途是食用，其次可以作為潤滑油，紡織用油及制皂品的原料［16］。超臨界流體CO2萃取油脂非皂化物質的含量明顯高于(P＜0.05)其他方法，表明該油中甾醇、高分子醇類、樹脂、蛋白質、蠟、色素、VE等非皂化物質含量更高。

2.3 檸檬苦素類物質測定結果

圖1為檸檬苦素、諾米林標準品的高效液相色譜圖，檸檬苦素的保留時間為26.8 min，諾米林保留時間為38.7 min。

圖1 檸檬苦素和諾米林標準品HPLC圖譜Fig.1 HPLC profiles of limonene and nomilin standard

實驗得到檸檬苦素標準曲線回歸方程為:Y=0.241 8X-0.028 7，相關系數(shù)為0.998，諾米林標準曲線回歸方程為:Y=0.195 8X+0.019 4，相關系數(shù)為0.998 2。表3為4種方法所提油脂檸檬苦素類似物含量。其中，超臨界CO2流體萃取油脂的含量最高為1.891 mg/g，溶劑萃取油脂的含量最低，僅0.166 mg/g。檸檬苦素作為柑橘種子中主要的生物活性物質，具有抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抑制腫瘤細胞等生理功能［17-19］。溫靖等人［20］發(fā)現(xiàn)柑桔種子中檸檬苦素類物質具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，且沒有劑量依賴關系。因此長葉橙種子油具有作為傷痛患者食用油的潛力。

表3 不同方法萃取油脂檸檬苦素類似物含量 單位:mg/gTable 3 Limonoids content of oil extracted by different methods

2.4 脂肪酸組成分析結果

表4為不同方法所得油脂中脂肪酸的組成及相對含量。分析可知，不同的萃取方法對長葉橙種子油中脂肪酸的組成及含量影響較小，其主要成分為棕櫚酸(30.71% ～33.23%)、硬脂酸(11.0% ～13.77%)、油酸(34.04% ～40.63%)、棕櫚油酸(3.10% ～4.80%)、亞油酸(3.95% ～13.24%)，此外還含有少量的亞麻酸(0.35% ～1.1%)和二高-γ-亞麻酸(0.19% ～0.41%)。飽和脂肪酸(SFA)與不飽和脂肪酸(單不飽和脂肪酸MUFA與多不飽和脂肪酸PUFA)比例約為1∶1。這與 matthaus等［3］研究的8 種土耳其柑橘種子油和9種越南柑橘種子油的主成分相似。除溶劑法提取的長葉橙種子油外，其余3種方法所提油脂都含有微量的二高-γ-亞麻酸(C20:3n-6c)。已有不少研究表明，二高-γ-亞麻酸作為前列腺素合成的前體，具有擴張血管的功能，是心肌梗塞的內(nèi)源性保護劑［21］。

表4 不同方法所得油脂的脂肪酸組成 %Table 4 Fat acid comparison of oil extracted with different methods

2.5 貯藏能力測定結果

圖2為不同方法萃取長葉橙種子油在自氧化過程中過氧化值的變化曲線。4種方法所得油脂初期過氧化值增加緩慢，144 h后增長都加快，這可能是因為油脂中不飽和脂肪酸、抗氧化物質如VE等被完全破壞被消耗導致。超臨界CO2萃取油脂過氧化值增長速度均大于其他方法所得油脂，一方面與超臨界CO2流體萃取油脂初始酸價較高相關［22］，另一方面超臨界CO2流體萃取所得柑橘種子油的色澤明顯要高于其他方法所得油脂，因此超臨界CO2流體萃取油脂中可能含有更多的光敏因子。冷榨與熱榨初期增長趨勢一致，144 h后冷榨增長明顯快于熱榨油脂，這主要是由于冷榨油脂所含的水分高于熱榨，在高溫下對油脂的氧化起了促進作用［23］。

圖2 不同方法萃取油脂的過氧化值變化曲線Fig.2 Curve of peroxide value for oil extracted by different methods

圖3為不同方法提取長葉橙種子油自氧化過程中酸值的變化。4種方法所提油脂都隨時間延長其酸價增高，超臨界CO2流體萃取的油脂酸價明顯高于其他3種方法。在測定時間范圍內(nèi)，4種方法所得油脂的酸價都沒有超過國家對食用植物油原油的限定值4 mgKOH/g。

圖3 不同方法萃取油脂的酸價變化曲線Fig.3 Curve of acid value for oil extracted by different methods

過氧化值作為限制油脂品質的重要指標之一，可以通過自氧化過程中過氧化值變化曲線推算出油脂的貨架壽命。根據(jù)于修燭試驗［24］可知，Schaal試驗24 h相當于20℃貯藏15 d，由此可推算出超臨界CO2流體萃取長葉橙種子油的貨架壽命為41.7 d，溶劑萃取為71.7 d，冷榨為92.4 d，熱榨為80.9 d。超臨界CO2流體萃取所得油脂初始酸價較高，導致其貯藏能力下降，因此為提高油脂的品質可采取化學堿煉法、分子蒸餾脫酸法［25］、酯化脫酸法［26］、膜技術脫酸法［27］和吸附法［28-29］等方法來降低游離脂肪酸的含量。

3 結論

長葉橙種子粗脂肪含量為33.80%，超臨界CO2流體萃取法萃取率最高(68.04%)。4種方法所萃取油脂的初始理化指標都符合食用植物油衛(wèi)生標準，且屬于不干性油脂。除溶劑提取法外，另3種方法所得油脂都含有檸檬苦素類似物，超臨界CO2流體萃取油脂含量最高為1.89 mg/g。長葉橙種子油中脂肪酸的主要成分為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等，此外還含有微量的二高-γ-亞麻酸。其中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比值約為1。經(jīng)Schaal烘箱法測定4種方法所提長葉橙種子油自氧化能力，并推算出超臨界CO2流體萃取油脂的貨架期最短為41.7 d，冷榨油脂貨架期最長為92.4 d。

采用超臨界CO2流體萃取法時，其油脂萃取率最高，且該方法是利用無毒無味的CO2作為萃取劑，也符合目前消費者對食品安全的要求。此外，超臨界CO2流體所得油脂中檸檬苦素類似物、二高-γ-亞麻酸含量都為最高值，具有作為保健油脂的潛力，但需要進一步降酸處理，以提高其貯藏能力。

［1］ 田代華.實用中藥詞典［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

［2］ Ei-adawy T A，Rahma E H，Ei-bedawy A A，et al.Properties of some citrus seeds.Part 3.Evaluation as a new source of protein and oil［J］.Nahrung，1999(43)6:385-391.

［3］ Matthaus B，Ozcan M M.Chemical evaluation of citrus seeds，an agro-industrial waste，as a new potential source of vegetable oils［J］.Grasas y Aceites，2012，63(3):313-320.

［4］ Tressler D K，Joslun M A.Fruit and vegetable juice processing technology［M］.Westport:Avi Publishing Company，1961:116.

［5］ 董慶亮，劉凌，崔明學.檸檬籽油中幾種活性成分的分析與檢測［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(3):103-106.

［6］ 郭燁.柚子籽油營養(yǎng)分析及其微膠囊制備［D］.南昌:南昌大學，2012.

［7］ 重慶市扶貧開發(fā)辦公室.江津區(qū):長葉橙94-1受好評-重慶市扶貧開發(fā)辦公室［EB/OL］.(2012-02-14)［2014-12-3］.http://www.cqfp.gov.cn/contents/438/32511.htmL

［8］ 郭燁.柚子籽油營養(yǎng)成分分析及其微膠囊制備［D］.南昌:南昌大學，2012.

［9］ Dias I，Yaakob B C，Shuhaimi M，et al.Lard detection based on fatty acids profile using comprehensive gas chromatography hyphenated with time-of-flight mass spectrometry［J］.Food Chemistry，2010，122(4):1 273-1 277.

［10］ AOAC Official Method 996.06 Fat(Total，Saturated，and Unsaturated)in Foods.First Action 1996，Revised 2001.

［11］ 張琨等.漢麻籽油自氧化及抗氧化性能的研究［J］.中國油脂，2008，28(2):22-25.

［12］ 趙聲蘭，李濤，蔡紹芬，等.核桃油自氧化及其抗氧化性能的研究［J］.食品工業(yè)科技，2001，22(2):27-29.

［13］ 辛莉，施江.食用油品種及含量與油脂折射率關系的探究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(15):317-321.

［14］ GB/T 2716-2005.食用植物油衛(wèi)生標準［S］.

［15］ 趙云霞，王建中，吳迪，等.不同方法制取山杏仁油的實驗研究［J］.食品工業(yè)科技，2006，(27)06:59-63.

［16］ 劉玉環(huán)，鄭丹丹，高蔭榆，等.干性油資源、性質與利用［J］.林產(chǎn)化工通訊，2005，(39)3:42-46.

［17］ 鄭寶東.金柑檸檬苦素類化合物的提取純化、結構鑒定及生物活性研究［D］.福建:福建農(nóng)林大學，2013.

［18］ Nagini S.Chapter seven-neem limonoids as anticancer agents:modulation of cancer hallmarks and oncogenic signaling［J］.The Enzymes，2014，36:131-147.

［19］ GUO Yuan-zhu，LI Ping-bai，LIANG Liu，et al.Linmonoids from the fruits of melia toosendan and their NF-kB modulating activities［J］.Phytochemistey，2014，107:175-181.

［20］ 溫靖，施英，徐玉娟，等.柑桔果實中檸檬苦素抗炎鎮(zhèn)痛作用的研究［J］.食品科學，2007，28(11):515-518.

［21］ Wood D A，Butler S，Riemersma R A，et al.Adiposetissue and platelet fatty-acids and coronary heart-disease in Scottish men［J］.The Lancet，1984，(324)8395:117-121.

［22］ 闞建全.食品化學［M］.第2版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2010:73:1

［23］ 趙中原，丁梅，李唐濤.不同水分活性對油菜儲藏穩(wěn)定性的影響［J］.糧食儲藏，1989(5)18:19-23.

［24］ 于修燭.蘋果籽及蘋果籽油特性研究［D］.西安:西北農(nóng)林科技大學，2004.

［25］ 馬傳國，王興國，張根旺，等.分子蒸餾對高酸值花椒籽油脫酸的初探［J］.中國油脂，2001(3):50-52.

［26］ De B K，Bhattacharyya D K.Deacidification of high-acid rice bran oil by reesterification with monoglycerde［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1999，76:1 243-1 246.

［27］ Katikanlin S，Cheryan M.Deacidfying rice bran oil by solvent extraction and memberance technology［J］.Journal of the American Oil Chemists Society，1992，76:723-728.

［28］ Bogim G，Moonjung K，Hee J K，et al.Comparative study of soybean oil refining using rice hull silicate and commercial adsorbents［J］.Food Science and Biotechnology，2014(23)4:1 025-1 028.

［29］ Gnanasambandam R，Proctor A.Soy hull as an adsorbent source in processing soy oil［J］.Journal of the A-merican Oil Chemists Society，1997(74)6:685-692.