徐瑤，陳雪峰，劉寧

(陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

膳食纖維具有順腸通便、調(diào)節(jié)控制血糖濃度、降血脂、抑制結(jié)腸癌等多種生理功能［1］。蘋果汁、果醬在加工過程中會(huì)產(chǎn)生大量的蘋果渣，其中含有60%～90%膳食纖維，且水溶性膳食纖維含量約占13%，是制備膳食纖維的良好原料［2］。目前，這些果渣只有少部分被用作動(dòng)物飼料，大多被當(dāng)作廢料舍棄。因此，進(jìn)行蘋果渣綜合有效利用，不僅可以提高蘋果的附加值，而且有利于保護(hù)環(huán)境［3］。

從結(jié)構(gòu)上看，膳食纖維是由半乳糖、葡萄糖、木糖等聚合而成的雜多糖，植物多糖溶解度低，其自身不具備某些活性或生物活性很弱。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)硫酸酯化是一種有效的多糖修飾方法，硫酸酯化多糖具有抗HIV、抗腫瘤、抗凝血等多種生理活性［4］。因此，利用硫酸酯化修飾增加多糖的生理活性，已成為當(dāng)前開發(fā)藥品和保健功能食品的重要手段之一［5-6］。本試驗(yàn)結(jié)合前人的研究經(jīng)驗(yàn)和文獻(xiàn)報(bào)道，將超聲波用于輔助氨基磺酸硫酸酯化蘋果SDF，利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)等，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高效率。本實(shí)驗(yàn)以取代度為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化酯化工藝，旨在獲得一種高效、可控、反應(yīng)條件溫和的酯化方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果渣:陜西省海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司乾縣分公司提供;35%雙氧水、NaOH、濃 HCl、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、K2SO4、氨基磺酸、DMF、BaCl2、明膠等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS323S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇國華電器有限公司;HNE-20200-CTⅠ型超聲波聚能處理系統(tǒng)，蘇州工業(yè)園區(qū)海納科技有限公司;H-1850R型離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)器有限公司;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司;UV-1100紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司;高速萬能粉碎機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司;VECTOR22傅立葉變換紅外光譜儀，德國BRUKER公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蘋果SDF提取

采用水提醇沉法［7］。

1.3.2 蘋果SDF硫酸酯化

稱取1.0 g蘋果SDF，將其分散于DMF中，在攪拌條件下加入酯化劑氨基磺酸，使其與酯化試劑充分混勻，于一定溫度，超聲頻率下，反應(yīng)一段時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用2.5 mol/L NaCl溶液調(diào)節(jié)pH值為中性，加入4倍體積95%乙醇醇沉，將沉淀溶于蒸餾水并裝入透析袋中，蒸餾水透析3 d，透析液加入4倍體積95%乙醇醇沉，靜置12 h，離心并收集沉淀，干燥即得SSDF。采用氯化鋇-明膠比濁法［8］，測定其酯化取代度，每個(gè)樣品測定3次重復(fù)，以ˉx±s表示，使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為0.05。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

按照1.3.2試驗(yàn)方法，以取代度為考察指標(biāo)，進(jìn)行蘋果水溶性膳食纖維硫酸酯化工藝的單因素試驗(yàn)研究，試驗(yàn)考察各因素不同水平對硫酸酯化效果的影響。具體選擇各因素的水平如下:蘋果SDF與氨基磺酸比例(g∶g)為 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酯化反應(yīng)起始溫度為 50、60、70、80、90℃，超聲波頻率為 20、25、30、35、40、45 kHz，蘋果 SDF 與 DMF(g∶mL)比為1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90，酯化時(shí)間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，測定硫酸酯化蘋果SDF的取代度。

1.3.4 SDF硫酸酯化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取SDF與氨基磺酸比例(A)、酯化起始溫度(B)、超聲波頻率(C)、蘋果SDF與DMF比(D)、酯化時(shí)間(E)為因素，以取代度為考察指標(biāo)，采用L16(45)正交設(shè)計(jì)，研究SDF硫酸酯化最佳工藝條件，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 L16(45)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Orthogonal experiment design of L16(45)

1.3.5 紅外光譜分析

分別取蘋果SDF及其硫酸酯化樣品，與KBr研磨壓片，在4 000～400 cm-1內(nèi)進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，對紅外光譜圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDF與氨基磺酸比例對硫酸酯化效果的影響

控制酯化反應(yīng)起始溫度60℃，蘋果SDF與DMF比為1∶70，超聲波頻率30 kHz，酯化時(shí)間2 h，研究蘋果SDF與氨基磺酸比對酯化效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)蘋果SDF與氨基磺酸比例在1∶1～1∶3(g∶g)內(nèi)，隨著氨基磺酸比例增加，取代度增大。這是因?yàn)榘被撬嶙鳛榱蛩峄噭峁猄O3H基團(tuán)，含量低酯化反應(yīng)不完全，因此，當(dāng)比例為1∶3時(shí)，取代度達(dá)到最大0.81。隨后取代度降低，這可能因?yàn)榘被撬徇^量，反應(yīng)體系酸性過強(qiáng)，部分氨基磺酸作用于蘋果SDF糖苷鍵上，使得SDF降解，這與劉昱均［9］研究結(jié)果一致。

2.2 酯化溫度對硫酸酯化效果的影響測定

圖1 SDF與氨基磺酸比例對硫酸酯化效果的影響Fig.1 The effect of the mass ratio of SDF and amino acid on sulfation

控制蘋果SDF與氨基磺酸比為1∶3(g∶g)，與DMF 比為 1∶70(g∶mL)，超聲波頻率 30 kHz，酯化時(shí)間2 h，研究酯化溫度對酯化效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，當(dāng)酯化反應(yīng)起始溫度由50℃升高到70℃，其反應(yīng)終點(diǎn)溫度由56℃升高到75℃時(shí)，蘋果SDF硫酸基取代度隨著酯化反應(yīng)體系溫度升高而增大，當(dāng)起始溫度為70℃，終點(diǎn)溫度為75℃時(shí)，取代度最大0.89。這是因?yàn)殡S著酯化反應(yīng)體系溫度升高，有利于氨基磺酸與DMF溶劑相互作用，使—SO3H上氧原子的電子云密度增大，親核性增強(qiáng)，從而有利于—SO3H的進(jìn)攻取代。另外，酯化反應(yīng)體系溫度升高分子間的熱運(yùn)動(dòng)加劇，增加蘋果SDF與氨基磺酸之間的碰撞機(jī)會(huì)，提高蘋果SDF酯化效果。當(dāng)起始溫度在70～90℃，終點(diǎn)溫度75～94℃內(nèi)，隨著溫度的進(jìn)一步升高，取代度降低，而且酯化反應(yīng)體系溫度過高得到的SSDF顏色深，產(chǎn)率低。可能是因?yàn)樘O果SDF在高溫及酸性條件下，部分發(fā)生了降解，同時(shí)氨基磺酸在高溫下會(huì)分解，產(chǎn)生硫氧化物，酯化劑利用率降低，并伴隨著副反應(yīng)的發(fā)生。

圖2 酯化反應(yīng)起始溫度對硫酸酯化效果的影響Fig.2 The effect of the reaction temperature on sulfation

2.3 超聲頻率對硫酸酯化效果的影響

控制酯化反應(yīng)起始溫度60℃，蘋果SDF與氨基磺酸比例為1∶3，與 DMF 比為1∶70，酯化時(shí)間2 h，研究超聲波頻率對酯化效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)超聲頻率在20～35 kHz內(nèi)變化時(shí)，隨著超聲頻率增大，取代度增加，主要由于超聲波的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，加大蘋果SDF與酯化劑氨基磺酸的接觸面積，促進(jìn)酯化反應(yīng)進(jìn)行;當(dāng)超聲頻率超過35 kHz，取代度降低?？赡茉谒嵝原h(huán)境中加之較大的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，會(huì)造成蘋果SDF一定程度的降解，并伴隨副反應(yīng)的發(fā)生。因此，選取超聲頻率為35 kHz。

圖3 超聲頻率對硫酸酯化效果的影響Fig.3 The effect of ultrasonic frequency on sulfation

2.4 SDF與DMF比例對硫酸酯化效果的影響

控制酯化反應(yīng)起始溫度60℃，蘋果SDF與氨基磺酸比例為1∶3，超聲波頻率30 kHz，酯化時(shí)間2 h，研究SDF與DMF比對酯化效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，當(dāng)蘋果SDF與DMF比例由1∶50增加到1∶70時(shí)，取代度增加，當(dāng)蘋果SDF∶DMF為1∶70時(shí)，取代度最大為0.81，如進(jìn)一步增加料液比，取代度降低。造成這一現(xiàn)象原因可能是當(dāng)蘋果SDF與DMF比例過小時(shí)，蘋果SDF與氨基磺酸難以分散均勻，造成反應(yīng)底物接觸面積小，反應(yīng)不充分;當(dāng)蘋果SDF與DMF比例過大時(shí)，導(dǎo)致反應(yīng)底物濃度過低，底物之間碰撞概率低，不利用酯化反應(yīng)的進(jìn)行。因此，選取蘋果SDF與DMF比為1∶70。

圖4 SDF與DMF比例對硫酸酯化效果的影響Fig.4 The effect of mass volume ratio of SDF and DMF on sulfation

2.5 酯化時(shí)間對硫酸酯化效果的影響

控制酯化反應(yīng)起始溫度60℃，蘋果SDF與氨基磺酸比例為1∶3，與DMF比為1∶70，超聲波頻率30 kHz，研究酯化時(shí)間對酯化效果的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，在反應(yīng)2 h內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，取代度增加，這是因?yàn)轷セ磻?yīng)是可逆反應(yīng)，需要一定時(shí)間才能達(dá)到動(dòng)力學(xué)平衡狀態(tài)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，分散在DMF溶劑中的蘋果SDF與氨基磺酸充分接觸，使硫酸酯化程度增加，取代度增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過2 h時(shí)，取代度降低，而且會(huì)增加副反應(yīng)的發(fā)生，產(chǎn)物顏色深。因此，選取反應(yīng)時(shí)間2 h。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對硫酸酯化效果的影響Fig.5 The effect of reaction time on sulfation

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

以取代度為考察指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，其因素水平如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表2極差值的大小可以得出，影響酯化反應(yīng)的主次順序?yàn)?酯化反應(yīng)起始溫度＞超聲頻率＞SDF與氨基磺酸比例(g∶g)＞SDF與DMF比例(g∶mL)＞酯化時(shí)間。獲得最高取代度的酯化工藝組合是A3B2C3D2E3，即SDF 與氨基磺酸(g∶g)比為1∶3，酯化反應(yīng)起始溫度為60℃，超聲功率35 kHz，SDF與 DMF(g∶mL)比1∶70，酯化時(shí)間1.5 h。按照最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)驗(yàn)證取代度為0.97。

2.7 硫酸酯化蘋果SDF紅外光譜分析

硫酸酯化前后蘋果SDF的紅外光譜分析如圖6所示。由圖6可知，SSDF除了保留了SDF的特征吸收峰外，在1 259.48 cm-1處出現(xiàn)伸縮振動(dòng)，800.44 cm-1處出現(xiàn)C—O—S拉伸振動(dòng)吸收峰。這兩個(gè)特征吸收峰表明蘋果SDF上的—OH已被硫酸基所取代。

圖6 硫酸酯化修飾前后紅外光譜圖Fig.6 FTIR spectra of sulfated before and after modification

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲波輔助蘋果SDF硫酸酯化，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到蘋果SDF硫酸酯化最佳工藝為:蘋果SDF與氨基磺酸(g∶g)比例為 1∶3，蘋果 SDF與 DMF比例為1∶70(g∶mL)，酯化反應(yīng)起始溫度60℃，超聲頻率35 kHz，酯化時(shí)間1.5 h，在此條件下硫酸酯化蘋果SDF的取代度為0.97。通過紅外光譜分析表明，硫酸酯化蘋果SDF具有硫酸酯化的特征吸收峰。本試驗(yàn)采用氨基磺酸-DMF法硫酸酯化蘋果SDF，相比目前常用的氯磺酸-吡啶法，酯化介質(zhì)DMF具有不易揮發(fā)、性質(zhì)溫和、毒性較小等優(yōu)點(diǎn)，該工藝操作簡單、易控制，能夠達(dá)到理想的酯化效果。

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