杜維，樸永哲，周彥品，王小瑜，趙長(zhǎng)新

1(大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連，116034)2(大連民族大學(xué)，遼寧 大連，116600)

分泌蛋白(secretory protein)是指細(xì)胞或組織分泌的蛋白，同胞內(nèi)蛋白一樣在參與細(xì)胞增殖、分化以及細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等重要生命過(guò)程中發(fā)揮作用［1］。深入了解分泌蛋白有助于弄清不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期、不同培養(yǎng)狀態(tài)下的細(xì)胞狀態(tài)信息，細(xì)胞異常時(shí)的病理病因以及認(rèn)識(shí)整個(gè)生命過(guò)程具有重要的意義［2］。Zwickl等［3］提供了一種代謝標(biāo)簽摻入的方法研究胞外蛋白，方法對(duì)HepG細(xì)胞和人肝組織切片進(jìn)行的研究結(jié)果證實(shí)對(duì)預(yù)防和治療肝癌其有廣泛的臨床應(yīng)用價(jià)值。相比于原核細(xì)胞，真核細(xì)胞具有大量結(jié)構(gòu)復(fù)雜的隔性間隔，為運(yùn)輸與分泌帶來(lái)比較大的困難。公認(rèn)的蛋白分泌途徑主要有2種［4］，一種是常規(guī)分泌途徑的信號(hào)假說(shuō) (signal hypothesis);另一種為非常規(guī)的蛋白質(zhì)分泌途徑，如白介素-1b、纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子等都是通過(guò)不依賴信號(hào)肽的非常規(guī)蛋白質(zhì)分泌途徑分泌的［5］。目前已對(duì)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)與分泌進(jìn)行了廣泛深入的研究，但至今對(duì)分泌途徑種類未有一個(gè)確切的定論。

衰老是自然界生物體的普遍規(guī)律，是作為生命載體-細(xì)胞的最終歸宿。衰老過(guò)程伴隨著復(fù)制生殖能力退化，細(xì)胞代謝不可逆減緩，細(xì)胞周期停滯，細(xì)胞生理及形態(tài)學(xué)同時(shí)也發(fā)生改變等。衰老包括復(fù)制性衰老和時(shí)序型衰老［6］，前者是指能復(fù)制出子代的個(gè)數(shù)，這種衰老與遺傳物質(zhì)的損傷有關(guān);時(shí)序型衰老是指在特定培養(yǎng)條件下菌體存活的時(shí)間。目前衰老體系已經(jīng)作為一種模式應(yīng)用到絲狀細(xì)菌(Podospora anserine)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophila melanogaster)和小鼠(Musmusculus)等模式生物中來(lái)研究復(fù)雜的衰老現(xiàn)象［7］。本文以釀酒酵母為載體，探究在釀酒酵母時(shí)序型衰老的狀態(tài)下胞外蛋白與胞內(nèi)酶活性之間的關(guān)系，探討衰老狀態(tài)下胞外蛋白來(lái)源的變化情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

Saccharomyces cerevisiae FFC 2144，大連工業(yè)大學(xué)菌種保藏中心。

1.1.2 儀器

湘儀高速冷凍離心機(jī)H2050R-1;MAPADA分光光度計(jì)UV6100;北京六一雙向電泳槽DYCZ-26B;北京博醫(yī)康冷凍干燥機(jī)VFD2000;上海智城恒溫?fù)u床ZWYR-2101C;大龍三維脫色搖床 SK-D3309-Pro;Congent超濾儀;超聲波細(xì)胞破碎儀XO-1000;Thermo Scientific臺(tái)式四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜儀等。

1.1.3 藥品

General Electric Company載體兩性電解質(zhì)pH 4-6.5，載體兩性電解質(zhì) pH 3-10。過(guò)硫酸銨、丙酮、苯酚、尿素(科密歐，優(yōu)級(jí)純)，愈創(chuàng)木酚，TCA，甲醇(科密歐，色譜純);ASB-14硫脲、CHAPS、色氨酸、組氨酸、YNB、精氨酸、丙烯酰胺、SDS(阿拉丁)。

1.1.4 培養(yǎng)基

采用改良無(wú)蛋白質(zhì)的全合成YNB培養(yǎng)基［8］，葡萄糖 2%，(NH4)2SO41%，YNB 0.67%，DL-蘋果酸0.6%，酒石酸0.2%，色氨酸0.5‰，組氨酸0.5‰，精氨酸0.5‰。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌體濃度

將菌液用含有0.05%瓊脂的無(wú)菌生理鹽水稀釋成不同的濃度梯度，取20 μL用九格法涂到Y(jié)PD平板上。每個(gè)平板3個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行。涂布后的平板放入28℃下培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并換算出實(shí)際活菌濃度。活菌濃度定義為每毫升溶液中能自身分裂產(chǎn)生子代的活菌數(shù)，單位CFU/mL。

1.2.2 老化培養(yǎng)

選取細(xì)胞兩種壽命中的時(shí)序型壽命作為考察條件，在菌體生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期末時(shí)轉(zhuǎn)入到無(wú)菌生理鹽水中培養(yǎng)，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)使酵母細(xì)胞老化，觀察細(xì)胞形態(tài)和酶活性等情況。

1.2.3 胞內(nèi)粗酶干粉的提取

將發(fā)酵液10 000×g，10 min離心棄掉上清得到酵母菌體，菌體沉淀用預(yù)冷PBS清洗3次，將清洗后的菌體放入研缽中液氮研磨。收集研磨后的菌體粉末，凍干保存。

1.2.4 胞外蛋白提取

用凍干/平衡酚-丙酮沉淀法提取胞外蛋白:將過(guò)0.22 μm膜后的發(fā)酵液直接凍干濃縮至80 mL，加入等體積的Tris-平衡酚(1 mol/L，pH 8.0)冰浴攪拌30 min后離心棄上清，保留酚相及中間層。加入3倍體積的濃度為100 mmol/L的乙酸銨-甲醇后于-20℃過(guò)夜沉淀，次日離心后的沉淀先用含有0.1%(w/v)DTT的冷丙酮清洗，再用冷丙酮清洗2次，每次10 min。清洗后的蛋白進(jìn)行真空干燥除去殘余丙酮，-80℃保存。

1.2.5 胞內(nèi)酶活性測(cè)定

精確稱取0.5 g粗酶干粉溶于10 mL PBS緩沖液中，漩渦振蕩促進(jìn)溶解后離心，上清液即為酶溶液。整個(gè)過(guò)程盡量低溫短時(shí)間內(nèi)完成以減少酵母胞內(nèi)自身酶系的相互作用。測(cè)定酶溶液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化物酶(peroxidase，POD)、蛋白酶的酶活性。在測(cè)定SOD、POD酶活性時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的PMSF以抑制蛋白酶對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。其中SOD酶用鄰苯三酚自氧化法［9］，將4.6 mL Tris-HCl 2×緩沖液與4.4 mL蒸餾水混合后加入100 μL粗酶液25℃水浴加熱20 min，在紫外波長(zhǎng)325 nm處每隔30 s，測(cè)3 min內(nèi)吸光值的變化與鄰苯三酚自氧化速率作對(duì)比。酶活力定義為每毫升酶液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的SOD量為1個(gè)SOD活力單位(U);用愈創(chuàng)木酚法［10］測(cè)定POD酶活性，將0.2 mol/L，pH 6.0的磷酸鹽緩沖液2.9 mL、2.0%的 H2021.0 mL、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1.0 mL、粗酶液0.1 mL搖勻，在37℃水浴中保溫15 min，立即加入10%的TCA 2 mL終止反應(yīng)，在470 nm處測(cè)量1 min吸光值的變化的平均值。以每分鐘吸光值變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U)。蛋白酶活性測(cè)定采用國(guó)標(biāo)法，酶活力定義為在40℃下，將每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸定義為1個(gè)活力單位。

1.2.6 胞外蛋白的雙向電泳

1.2.6.1 蛋白樣品的溶解及定量

取保存的蛋白質(zhì)干粉溶于適量的裂解液中(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，2%CHAPS，2%ASB-14，20 μL 3-10兩性電解質(zhì)，0.1%DTT)4℃過(guò)夜并用Bradford法［11］測(cè)定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)裂解液體積估算蛋白質(zhì)提取率，并將裂解液稀釋至上樣所需濃度。

1.2.6.2 等電聚焦

IEF 膠條的制作:取540 μL H2O，200 μL 30%丙烯酰胺，0.6 g尿素，4～6載體兩性電解質(zhì) 4.8 μL，3～10 載體兩性電解質(zhì) 24 μL，5 μL 10% 過(guò)硫酸銨，4 μL TEMED混勻并緩緩注入到玻璃管中(12 cm)，室溫聚合。等電聚焦電壓如下:300 V，30 min;500 V，1 h;800 V，1 h;1 600 V，4 h。

1.2.6.3 膠條平衡

首先將等電聚焦后的膠條由玻璃管的一端擠出放入含有0.2 g/mL DTT的平衡液中平衡15 min，然后再置于0.2 g/mL碘乙酰胺中平衡17 min。平衡液:6 mol/L尿素，體積分?jǐn)?shù)為20%甘油，2%SDS，50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8，1.5 mol/L)。

1.2.6.4 SDS-PAGE

將平衡后的膠條轉(zhuǎn)移到12%濃度的二維膠上進(jìn)行恒流電泳，參數(shù)為20 mA/gel 15 min，40 mA/gel直至溴酚藍(lán)移動(dòng)到膠條的最低端。

1.2.6.5 蛋白染色

Neuhoff考染法［12］

1.2.7 蛋白點(diǎn)鑒定

1.2.7.1 前期酶解

用去尖的槍頭從膠上切下蛋白點(diǎn)后清洗，加入50%乙腈/0.2 mol/L NH4HCO3(pH 8.0)進(jìn)行脫色，用100%ACN進(jìn)行脫水，凍干后的膠加入胰蛋白酶溶液進(jìn)行酶解。

1.2.7.2 質(zhì)譜樣品制備

向吸漲后的膠塊加入不含胰蛋白酶的50 mmol/L NH4HCO3緩沖液，放置在37℃培養(yǎng)箱反應(yīng)過(guò)夜。次日用掌式離心機(jī)離心，取出上清轉(zhuǎn)移至加入了60%CH3CN/5%TFA的新管中;在沉淀中加入超純水，孵育10 min，離心移出上清與前一管上清液混合;再向沉淀中加入60%ACN/0.1%TFA超聲15 min，吸出溶液，并入前次上清，反復(fù)抽提2次，將所得上清用真空離心濃縮儀干燥5 min，放入-80℃冰箱中過(guò)夜。次日凍干后-80℃保存。

1.2.7.3 質(zhì)譜分析

色譜條件:富集柱:C18(100 μm ×2 cm)，分析柱C18(75 μm ×15 cm，2 μm)，流動(dòng)相 a:98%H2O+2%CH3CN+0.1%TFA，流動(dòng)相 b:20%H2O+80%CH3CN+0.1%TFA，柱溫 35 ℃，流速 0.25 μL/min。質(zhì)譜條件:噴霧電壓2.5 kV，離子源溫度300℃，掃描范圍:m/z=300～2000。利用Xcalibue軟件和NCBI等相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 衰老過(guò)程中培養(yǎng)基內(nèi)活細(xì)胞數(shù)與胞外蛋白測(cè)定結(jié)果

將處于對(duì)數(shù)末期的酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)菌生理鹽水培養(yǎng)，每2天用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定活細(xì)胞數(shù)量以及胞外蛋白含量，結(jié)果如圖1所示。

圖1 衰老過(guò)程中胞外蛋白與活細(xì)胞數(shù)量關(guān)系圖Fig.1 The number of viable cells and extracellular protein content in the culture

圖1可知在無(wú)菌生理鹽水中培養(yǎng)的酵母細(xì)胞在8 d內(nèi)細(xì)胞數(shù)量基本維持穩(wěn)定，測(cè)定結(jié)果來(lái)看細(xì)胞數(shù)目峰值為107.25個(gè)/mL，到第8天時(shí)細(xì)胞數(shù)目為107.21個(gè)/mL?？蓮?fù)制出子代的活性細(xì)胞占峰值的92%以上，8%細(xì)胞中包括休眠細(xì)胞、死亡裂解細(xì)胞以及誤差等。圖1同時(shí)顯示8 d內(nèi)胞外蛋白含量沒(méi)有明顯升高，通過(guò)以上的數(shù)據(jù)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)方案的確定，盡量將細(xì)胞裂解對(duì)胞外蛋白組成的干擾降到最低，故第8天為胞外蛋白的最佳提取時(shí)間。從第8天開始活細(xì)胞數(shù)量顯著下降，胞外蛋白含量明顯增加。24天時(shí)細(xì)胞數(shù)量下降約1個(gè)單位左右，胞外蛋白濃度達(dá)到7.2 g/L。由此可知在無(wú)菌生理鹽水培養(yǎng)4 d內(nèi)細(xì)胞由于處在無(wú)外源C源的脅迫下，酵母產(chǎn)生了一種應(yīng)答機(jī)制［13］。這種應(yīng)答機(jī)制將利用胞內(nèi)儲(chǔ)存的能量合成并向外環(huán)境分泌蛋白酶和信號(hào)肽等胞外蛋白。隨著培養(yǎng)的繼續(xù)細(xì)胞內(nèi)能量耗盡，一部分細(xì)胞出現(xiàn)老化自溶，一部分細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)，這兩類細(xì)胞在菌落計(jì)數(shù)中不會(huì)被體現(xiàn)。有活性的菌體數(shù)每下降0.7個(gè)單位說(shuō)明有一半的細(xì)胞老化嚴(yán)重不能在充足營(yíng)養(yǎng)下短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出子代，在此過(guò)程中胞外蛋白含量急速上升，說(shuō)明有小部分細(xì)胞自溶亦或是酵母胞內(nèi)蛋白在向外排出。

2.2 衰老過(guò)程中胞內(nèi)酶活性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)圖1得到的數(shù)據(jù)酵母在無(wú)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中老化衰老，在第8天開始逐漸轉(zhuǎn)為休眠狀態(tài)亦或是老化凋亡。故8 d內(nèi)酵母形態(tài)及數(shù)目基本保持完整，有利于測(cè)定胞內(nèi)酶系變化。測(cè)定9 d內(nèi)酵母老化過(guò)程中胞內(nèi)SOD酶、POD酶、蛋白酶的變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 衰老培養(yǎng)過(guò)程中SOD酶、POD酶、蛋白酶活性Fig.2 The activities of SOD，POD and protease during long term fermentation in saline

SOD、POD酶是細(xì)胞抗氧化酶系中的關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)將對(duì)細(xì)胞有害的氧自由基(super oxygen anion，O2-)轉(zhuǎn)化成低害的H2O2，并最終轉(zhuǎn)化成無(wú)害的H2O，其活性的變化與細(xì)胞的氧化程度密切相關(guān)。故SOD、POD酶活性相對(duì)高低可以作為細(xì)胞老化程度的一個(gè)依據(jù)［14］。從圖上看，在持續(xù)饑餓脅迫下 SOD酶、POD酶的活性都呈先升高后降低的趨勢(shì)，在5～6天時(shí)達(dá)到峰值，而后迅速下降。在前5 d的衰老過(guò)程中SOD、POD酶活性上升以清除不斷增加的氧自由基，但5 d后由于細(xì)胞內(nèi)能量消耗殆盡導(dǎo)致胞內(nèi)抗氧化酶活性降低，不能及時(shí)清除不斷產(chǎn)生的自由基，自由基的積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞組織機(jī)能紊亂，進(jìn)而使細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡、老化加劇［15］。與之不同的是胞內(nèi)蛋白酶活性一直處于升高狀態(tài)，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加蛋白酶活性升高明顯。胞內(nèi)蛋白酶主要存在于溶酶體中，在細(xì)胞內(nèi)的消化器官、細(xì)胞自溶、防御以及對(duì)某些物質(zhì)的利用等方面起作用。5～6天時(shí)SOD、POD酶活性的降低與蛋白酶活性的急劇升高相對(duì)應(yīng)。胞外蛋白不斷增加的原因可能是細(xì)胞受到氧化性損傷，在老化狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)部分修飾錯(cuò)誤或老化失活的蛋白被降解從而排到細(xì)胞外。

2.3 雙向電泳圖譜比較

提取在YNB培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d的酵母胞外蛋白以及在無(wú)菌生理鹽水中衰老培養(yǎng)8 d的酵母胞外蛋白做雙向電泳，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酵母胞外蛋白雙向電泳圖譜Fig.3 Two-dimensional gel electrophoresis analysis of extracellular protein

從圖3來(lái)看兩張圖譜的特征相一致，在兩張圖的左側(cè)都出現(xiàn)并排的縱向條紋，在同一分子質(zhì)量上都有并排出現(xiàn)的橫向拖尾，且一半以上的蛋白點(diǎn)都可以相互識(shí)別。與正常培養(yǎng)時(shí)相比，衰老狀態(tài)下酵母胞外蛋白表達(dá)量大、蛋白點(diǎn)多20% ～30%，在局部放大圖中可以清晰地看到衰老培養(yǎng)比正常的圖多出許多分子質(zhì)量較低的隨機(jī)散亂的蛋白點(diǎn)。這說(shuō)明在饑餓脅迫下酵母逐漸衰老的過(guò)程中，胞外蛋白的組成發(fā)生了較大變化。

圖4 酵母胞外蛋白雙向電泳局部放大圖Fig.4 Magnification of two-dimensional gel electrophoresis

2.4 質(zhì)譜分析結(jié)果

質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，在9個(gè)鑒定結(jié)果中檢測(cè)到8個(gè)胞內(nèi)蛋白、1個(gè)胞外蛋白、1個(gè)蛋白為匹配。匹配到的胞外蛋白覆蓋率較高達(dá)到87.63%，匹配到的胞內(nèi)蛋白匹配率較低，基本都在30%以下。質(zhì)譜結(jié)果表明在衰老培養(yǎng)條件下，從圖譜上看散亂的點(diǎn)為胞內(nèi)蛋白。蛋白點(diǎn)與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配率不高，蛋白點(diǎn)多為對(duì)比目標(biāo)蛋白的碎片，而非完整蛋白。說(shuō)明這些蛋白經(jīng)過(guò)水解后排出到細(xì)胞外，這也與胞內(nèi)蛋白酶活性升高相吻合。初步推論為衰老過(guò)程中的酵母細(xì)胞將細(xì)胞內(nèi)的某些被破壞或失活的蛋白水解成碎片后排出到細(xì)胞外，而對(duì)于這些被排出的蛋白是否被進(jìn)行統(tǒng)一的修飾標(biāo)記以及這些蛋白的具體排出途徑有待于我們進(jìn)一步的論證。

表1 質(zhì)譜分析結(jié)果Table 1 The results of MS analysis

3 結(jié)論

本文在連續(xù)饑餓脅迫下對(duì)釀酒酵母進(jìn)行衰老培養(yǎng)，提取衰老狀態(tài)下的釀酒酵母胞外蛋白并用雙向電泳進(jìn)行圖譜分析。結(jié)合胞內(nèi)SOD酶、POD酶、蛋白酶活性變化，及質(zhì)譜的分析結(jié)果等得出在衰老狀態(tài)下SOD、POD酶活性先升高后降低，過(guò)氧化物酶活性的降低導(dǎo)致其不能及時(shí)清除衰老過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，胞內(nèi)氧活性自由基對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。同時(shí)蛋白酶活性的持續(xù)升高使胞外蛋白圖譜變化明顯，蛋白酶活性的升高將一部分老化組織降解成碎片，使此類的“垃圾蛋白”最終排出到胞外。

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