邵淑萍，張存勝，王振斌，任曉鋒，2，崔鳳杰，趙鵬翔，張軍宏

1(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江，212013)

2(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室(天津科技大學)，天津，300457)

3(國網(wǎng)節(jié)能服務有限公司北京生物質(zhì)能源技術(shù)中心，北京，100081)

近幾年來國內(nèi)外在醋糟的利用方面進行了較為廣泛的研究，目前醋糟的利用主要集中在“飼料資源”、“食用菌栽培料”和“植物無土栽培基質(zhì)”等方面。由于醋糟的蛋白質(zhì)含量較低，而粗纖維含量較高，消化率低、適口性差，所以不可用于單一飼喂。作為食用菌栽培料和植物無土栽培基質(zhì)，存在著處理量小、耗能大等缺點，不能滿足當前對醋糟進行大批量處理的要求。直接燃燒法可以實現(xiàn)對大批量醋糟的處理，但會造成大量的粉塵污染，且浪費了醋糟中的蛋白質(zhì)、淀粉等有機營養(yǎng)物質(zhì)。因此，選擇一種合理的醋糟處理方式很有必要［1-3］。

厭氧發(fā)酵技術(shù)已被有效地應用于農(nóng)業(yè)有機廢棄物資源化處理，可以將低值有機資源轉(zhuǎn)化生物能源和有機肥料［4］。以醋糟為研究對象，通過厭氧發(fā)酵技術(shù)制備氫氣和甲烷等生物能源氣體和有機肥，為其合理化利用提供了可能［5-6］。有文獻總結(jié)了產(chǎn)氫的最佳C/N為33～45［7-8］，在醋糟厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫過程中發(fā)現(xiàn)，由于醋糟纖維素、半纖維素和木質(zhì)纖維素等碳水化合物含量高，C/N高，直接影響了產(chǎn)氫微生物的生長，使得水解效率和產(chǎn)氫效率降低。針對此類問題，王志民［9］等在馬鈴薯薯渣厭氧發(fā)酵過程中添加2% ～2.5%尿素，陳廣銀［10］等對不同氮源對麥稈厭氧發(fā)酵過程和體系氮形態(tài)的變化進行了研究。然而，目前對于醋糟不同氮元素添加后厭氧制氫產(chǎn)率、發(fā)酵類型及發(fā)酵前后氮形態(tài)變化的影響并沒有相關(guān)報道。

本文首先確定了醋糟發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳C/N。通過添加氯化銨、尿素和硝酸鉀分別代表有機氮、氨基氮和硝基氮，在確定最佳C/N的條件下，對其產(chǎn)氣特性、發(fā)酵液成分變化以及發(fā)酵前后氮形態(tài)的轉(zhuǎn)化進行了較系統(tǒng)研究，考察了外源氮元素添加對醋糟厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫過程的影響，以期為醋糟的厭氧發(fā)酵提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

醋糟:新鮮醋糟取自鎮(zhèn)江恒康調(diào)味品廠，自然風干，置于干燥陰涼處備用。

接種物:產(chǎn)氫菌通過活性污泥馴化后得到。污泥取自江蘇大學鏡湖，過2 mm篩去除枝葉等雜質(zhì)，先于40 L污泥罐中培養(yǎng)3個月至最大活性，用6 mol/L的NaOH調(diào)整pH至12.0±0.1，室溫維持24 h，抑制污泥中的產(chǎn)甲烷細菌，用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至6.0±0.1備用。

分析純試劑:氯化銨、硝酸鉀和尿素。

醋糟和活性污泥的特征列于表1。

表1 醋糟和活性污泥的特征Table 1 Characteristics of the raw vinegar residue and anaerobic sludge

1.2 醋糟厭氧發(fā)酵過程

將30 g總固形物(Total Solid，TS)的醋糟與pH調(diào)至1的HCl以料液比10 mL/g混合，于99℃水浴加熱30 min后冷卻至室溫，加入氮源。300 mL預處理過的活性污泥與30 g TS預處理的醋糟混合于1 L發(fā)酵瓶，用蒸餾水補足有效體積800 mL，用6 mol/L的NaOH和HCl將系統(tǒng)的初始pH調(diào)至6.0±0.1，迅速加塞密封充入高純氬氣制造厭氧環(huán)境。于37℃水浴鍋進行厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫實驗。每組做3次平行實驗。產(chǎn)生的氣體通過排水法收集，取厭氧發(fā)酵前后的發(fā)酵液對氨氮NH3-N、硝基氮NO3-N、亞硝基氮NO2-N、總氮(Total Nitrogen，TN)和揮發(fā)性脂肪酸(Volatile Fatty Acid，VFA)進行進一步分析。

1.3 添加氮源實驗過程

首先以尿素為氮源，考察不同 C/N(20、30、40、50)對醋糟厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的影響;在確定最佳C/N的條件下，以尿素、氯化銨和硝酸鉀分別代表有機氮、氨基氮和硝基氮，研究不同外源氮元素對產(chǎn)氫過程的影響。

1.4 化學分析

總固形物 TS、揮發(fā)性固形物 (Volatile Solid，VS)、pH、還原糖、NH3-N、NO3-N、NO2-N 和 TN 通過標準方法測定［11］;總碳通過TOC分析儀測定(TOCV，Shimadzu日本);蛋白質(zhì)含量通過凱氏定氮測定。

用氣相色譜儀(SP-6890，魯南瑞虹，中國)進行氣體成分的測定，氣相色譜儀為TCD檢測器，裝有TDX-01不銹鋼柱(2 m×3 mm，配碳分子篩)。進樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為140、160和160℃。載氣為氬氣，檢測器電流60 mA壓力0.08 MPa，流速25 mL/min。

液相產(chǎn)物的揮發(fā)性脂肪酸(VFAs)由氣相色譜儀(GC-5890，HP)檢測，配有氫離子檢測器(FID)和毛細管柱(安捷倫1909/N-133HP-INNOWAX 30 m×0.250 mm)。FID的進樣口和檢測器溫度分別為240℃和260℃。柱溫程序升溫:初溫100℃保持1 min，以15℃/min的速率升溫至220℃保持5 min。氮氣作為載氣，氮氣、氫氣和空氣的流速分別為290 mL/min，170 mL/min和290 mL/min。

1.5 數(shù)據(jù)分析

應用ORIGIN8.0數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳C/N的確定

醋糟的有機質(zhì)含量較高，其TS、VS和VS/TS分別達到30.8%、27.4%和89.1%(表1)，表明醋糟適合發(fā)酵產(chǎn)氣?；钚晕勰嗟腣S/TS只有20%，表明污泥缺少有機質(zhì)。此外，作為發(fā)酵底物的醋糟總碳含量為35.6%，總氮含量只有0.56%，表明醋糟富含碳水化合物。其C/N高達64，高于發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳碳氮比［7-8］，不適合直接用于厭氧發(fā)酵。因此在實驗中需要加入一定量氮源。

圖1 C/N對產(chǎn)氫的影響Fig.1 Effect of C/N on hydrogen yield

圖1為通過添加尿素調(diào)節(jié)不同的C/N得到的累積產(chǎn)氫量。由圖1可得:加入適量的尿素均可以顯著提高氫氣產(chǎn)量，表明添加適量氮源能夠提高產(chǎn)氣量。這是因為添加氮源提高了厭氧微生物的活性，促進了醋糟中有機物向氫氣的轉(zhuǎn)化［12］。C/N為40時氫氣產(chǎn)量最高，比對照組提高了42%。Chakkrit［13］等報道的最佳C/N 33.14，活性污泥中的微生物混合菌群不同導致最佳C/N有所區(qū)別。C/N(20)較低時產(chǎn)氫量反而低于對照組，這是因為由蛋白質(zhì)和其他氮成分轉(zhuǎn)化成的游離氨離子會抑制細胞生長，從而降低產(chǎn)氣量［14］。結(jié)果表明合適的碳氮比可以促進發(fā)酵的進行，提高氫氣產(chǎn)量。本研究得到醋糟產(chǎn)氫的最佳C/N為40。

2.2 添加不同氮源對產(chǎn)氫過程的影響

表2為添加不同氮源后發(fā)酵體系的產(chǎn)氣特性和發(fā)酵液的成分變化。從表2可以得到，添加以氯化銨為代表的氨氮氮源、硝酸鉀為代表的硝基氮源和尿素為代表的有機氮源，醋糟的產(chǎn)氣量均有不同程度的增加，表明添加適量氮源能夠促進發(fā)酵的進行。最終產(chǎn)氣量以氨氮氮源組增加最多，氫氣含量達到85 mL/g-VS，其次為有機氮源組，硝基氮源組產(chǎn)氣量最少，氫氣產(chǎn)量分別提高了57%、46%和21%。各實驗組氫氣濃度均在60%～62%。還原糖的利用率較對照試驗均有提高，尤其是氯化銨組，還原糖的利用率達到73.5%，對應著最高氫氣產(chǎn)量。表明適量的加入氮源有利于還原糖等有機質(zhì)的充分利用，提高產(chǎn)氣量。

表2 不同氮源對產(chǎn)氫過程的影響Table 2 The influence of different N resource on digestion process

總酸含量發(fā)酵前基本一致，均低于2 500 mg/L，發(fā)酵后VFA含量與氫氣產(chǎn)量增減趨勢一致，累積VFA的最高含量為9 282 mg/L，出現(xiàn)在累積產(chǎn)氫量最高的氯化銨組，結(jié)果表明產(chǎn)氫過程會造成VFA的積累。VFA的積累會造成pH的下降，然而本實驗各加氮組中總酸含量均顯著高于對照組，而pH卻高于對照組的5.04，表明氮源的加入起到緩沖劑的作用，能夠有效調(diào)節(jié)系統(tǒng)的酸堿度。尿素等轉(zhuǎn)化的氨氮呈堿性，也有助于調(diào)節(jié)發(fā)酵過程的pH，維持系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

圖2為發(fā)酵末端產(chǎn)物中VFA組成。由圖2可以看出，發(fā)酵后各組的VFA主要成分是乙醇、乙酸和丁酸。其中每組都是乙酸含量最高，酸的生成能為固氮酶提供ATP有助于產(chǎn)氫，所以在產(chǎn)氫良好情況下乙酸的濃度比較高［15］。對照組和尿素組的丁酸含量僅次于乙酸含量，屬于丁酸型發(fā)酵，這是碳水化合物類的典型發(fā)酵類型［16］。加入氮源后，各組的乙醇含量較對照組都有所上升，體系pH維持在5.2左右。氯化銨組和硝酸鉀組中乙醇含量高于丁酸，呈現(xiàn)以乙醇為主要液相末端產(chǎn)物、產(chǎn)氫率高的代謝特征。這表明添加適量的氮源可以將系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為促進產(chǎn)氫的乙醇型發(fā)酵。這是因為形成丁酸型發(fā)酵類型的典型微生物是梭菌屬，而乙醇型發(fā)酵起主要作用的微生物為消化鏈球菌屬，氮源的添加改變了污泥厭氧發(fā)酵體系中的優(yōu)勢產(chǎn)酸菌群而促使不同厭氧發(fā)酵類型的形成［17］。加入氮源后丁酸含量降低是最終pH升高的原因之一。除乙酸和丁酸，發(fā)酵液中還有丙酸、異丁酸、正丁酸、異戊酸、正戊酸和己酸存在，但它們的含量均低于300 mg/L，不會對產(chǎn)氫菌活性造成抑制［18］。

圖2 不同氮源對VFA組成影響Fig.2 The influence of different N resource on VFA composition

表3 發(fā)酵前后氮形態(tài)的組成Table 3 The composition of N form before and after digestion

表3為加入不同氮源后發(fā)酵體系內(nèi)不同形態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。厭氧發(fā)酵過程伴隨著各種形態(tài)氮素的相互轉(zhuǎn)化，厭氧微生物分解有機物，將有機物中的有機氮轉(zhuǎn)化為無機氮，與此同時，微生物利用系統(tǒng)中的無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮。由表3可得，實驗各組在發(fā)酵后的總氮含量均有所升高，表明醋糟中的有機氮被大量分解轉(zhuǎn)化為無機氮溶入發(fā)酵液中，其中一些不能為厭氧微生物分解的有機物也溶出進入發(fā)酵液中。醋糟被發(fā)酵的含氮物質(zhì)高于發(fā)酵過程被利用的含氮物質(zhì)使得總氮含量升高。

氮的轉(zhuǎn)化過程包括氨化、硝化和反硝化3個階段。氨氮在亞硝化桿菌的作用下可以生成亞硝酸鹽，并在硝化桿菌作用進一步形成硝酸鹽，同時水中的亞硝酸鹽也可以在厭氧條件下受微生物作用轉(zhuǎn)化為氨［19］。各實驗組氮主要以氨氮形式存在，除了硝酸鉀組，添加氮源對系統(tǒng)的亞硝基氮和硝基氮的含量影響不大。發(fā)酵前后，亞硝基氮和硝基氮的含量均有明顯下降，表明它們在發(fā)酵過程中被利用。對于氨氮形態(tài)，添加氯化銨組氨氮含量降低，硝酸鈉組氨氮出現(xiàn)大量積累，尿素組在發(fā)酵后氨氮含量略有上升。說明厭氧發(fā)酵過程中同時發(fā)生了氨化作用和硝化作用，以氨化作用為主。當氨氮濃度達到200 mg/L時，會產(chǎn)生氨氮的抑制作用［20］，而本實驗由于氮源含量很低，最高的氨氮含量22.69 mg/L遠低于抑制濃度，氨氮沒有產(chǎn)生抑制作用，反而作為無機氮源被發(fā)酵利用，促進發(fā)酵的進行。

3 結(jié)論

(1)醋糟發(fā)酵產(chǎn)氫的最佳C/N為40。添加外源氮元素可以提高醋糟發(fā)酵產(chǎn)氫性能。在各種氮源中，以添加氨氮的效果最好，氫氣產(chǎn)量達到85 mL/g-VS，較對照組提高了57%。

(2)添加氯化銨和尿素可將發(fā)酵類型由丁酸型轉(zhuǎn)變?yōu)橐掖夹?，促進氫氣產(chǎn)率的提高。

(3)厭氧發(fā)酵后發(fā)酵液中總氮含量均有增加;發(fā)酵液中的氮以氨態(tài)氮為主，氨化作用強于硝化作用，部分氨氮可以作為有機質(zhì)被利用;除硝酸鉀組，添加氮源對發(fā)酵液中硝態(tài)氮含量的影響不大，發(fā)酵后硝基態(tài)氮含量均有下降。

［1］ SONG Z T，DON X F，TONG J M，et al.Effects of inclusion of waste vinegar residue in the diet of laying hens on chyme characteristics and gut microflora［J］.Livestock Science，2014，167:292-296.

［2］ ZHONG M，WANG Y，YU J，et al.Porous carbon from vinegar lees for phenol adsorption［J］.Particuology，2012，10(1):35-41.

［3］ 陳曉寅，王振斌，馬海樂，等.醋糟的利用現(xiàn)狀及前景［J］.中國釀造，2010(10):1-3.

［4］ ZHANG C，XUAN G，PENG L，et al.The anaerobic co-digestion of food waste and cattle manure［J］.Bioresource Technology，2013，129:170-176.

［5］ Kim M，Liu C，Noh JW，et al.Hydrogen and methane production from untreated rice straw and raw sewage sludge under thermophilic anaerobic conditions［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2013，38(21):8 648-8 656.

［6］ Zhu H，Stadnyk A，Beland M，et al.Co-production of hydrogen and methanefrom potato waste using a two-stage anaerobic digestion process［J］.Bioresource Technology，2008，99(11):5 078-5 084.

［7］ Sreethawong T，Chatsiriwatana S，Rangsunvigit P，et al.Hydrogen production from cassava wastewater using an anaerobic sequencing batch reactor:effect of operational parameters，COD∶N ratio，and organic acid composition［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2010，35(9):4 092-4 102.

［8］ Sreela-or C，Plangklang P，Imai T，et al.Co-digestion of food waste and sludge for hydrogen production by anaerobic mixed cultures:statistical key factors optimization［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2011，36(21):14 227-14 237.

［9］ 王志民，蔡光澤，陳開陸，等.不同尿素添加量對馬鈴薯薯渣厭氧發(fā)酵產(chǎn)物品質(zhì)的影響研究［J］.西昌學院學報，2009，23(4):1-3.

［10］ 陳廣銀，鄭正，常志州，等.不同氮源對麥稈厭氧消化過程的影響［J］.中國環(huán)境科學，2011，31(1):73-77.

［11］ Kabel MA，Bos G，Zeevalking J，et al.Effect of pretreatment severity on xylan solubility and enzymatic breakdown of the remaining cellulose from wheat straw［J］.Bioresource Technology，2007，98(10):2 034-2 042.

［12］ MC Sterling Jr，R E Lacey，CR Engler，et al.Effects of ammonia nitrogen on H2and CH4production during anaerobic digestion of dairy cattle manure［J］.Bioresource Technology，2001，77(1):9-18.

［13］ Chakkrit S，Pensri P，Tsuyoshi I，et al.Co-digestion of food waste and sludge for hydrogen production by anaerobic mixed cultures:Statistical key factors optimization［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2011，36(21):14 227-14 237.

［14］ Sontaya K，Alissara R.Co-digestion of oil palm trunk hydrolysate with slaughter house wastewater for thermophilic bio-hydrogen production by Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticm KKU19［J］.International Journal of Hy-drogen Energy，2014，39(13):6 872-6 880.

［15］ 張明輝.藍藻發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的機理研究［D］.杭州:浙江大學，2011.

［16］ Quéméneur M，Hamelin J，Barakat A，et al.Inhibition of fermentative hydrogen production by lignocellulose-derived compounds in mixed cultures［J］.International Journal of Hydrogen Energy，2012b，37(4):3 150-3 159.

［17］ 劉和，劉曉玲，邱堅，等.C/N對污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸類型及代謝途徑的影響［J］.環(huán)境科學學報，2010，30(2):340-346.

［18］ WANG L，ZHOU Q，LI FT.Avoiding propionic acid accumulation in the anaerobic process for biohydrogen production［J］.Biomass Bioenergy，2006，30(2):177-182.

［19］ 謝建華，劉海靜，王愛武.淺析氨氮、總氮、三氮轉(zhuǎn)化及氨氮在水污染評價及控制中的作用［J］.內(nèi)蒙古水利，2011(5):34-36.

［20］ Lise Appels，Jan Baeyens，Jan Degre`ve，et al.Principles and potential of the anaerobic digestion of waste-activated sludge［J］.Progress in Energy and Combustion Science，2008，34(6):755-781.