魏玉潔，付方圓，武順，鄒彎，薛潔，閆寅卓，武運

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊，830052)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015)

葡萄酒釀造是一個復(fù)雜的過程，其中由酵母菌主導(dǎo)的酒精發(fā)酵過程是最為關(guān)鍵的工藝步驟，釀酒酵母性能的優(yōu)劣不僅對葡萄酒的口感和風(fēng)味影響很大，而且還直接影響到所釀葡萄酒的產(chǎn)量、質(zhì)量，甚至是安全性［1］。氨基甲酸乙酯(carbamate ethyl)是一種具有遺傳毒性和致癌性的酵母代謝副產(chǎn)物［2-3］，被國際癌癥研究機構(gòu)確認(rèn)為人類可能致癌物質(zhì)(2A類)［4］，因此生產(chǎn)上應(yīng)盡可能降低葡萄酒中EC的含量。

葡萄酒中的EC形成主要與前體物質(zhì)尿素和瓜氨酸有關(guān)［5-8］，它們在葡萄酒中的積累分別是釀酒酵母和蘋果酸乳酸細(xì)菌對葡萄汁中精氨酸代謝的結(jié)果。本課題前期研究結(jié)果表明，與乳酸菌相比，釀酒酵母代謝精氨酸產(chǎn)生尿素對葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的影響更為重要［9］。研究證明，酵母代謝產(chǎn)生尿素的關(guān)鍵酶是精氨酸酶［10-11］，許多研究者對此途徑酶的基因及其調(diào)控進行了研究。在葡萄酒酵母中，編碼精氨酸酶的基因是car1，基于此Suizu等通過破壞car1基因構(gòu)建不產(chǎn)尿素的清酒酵母［12］，因此推斷car1基因的活性與葡萄酒中尿素和EC的含量密切相關(guān)。

實時熒光定量PCR(real-timePCR)實現(xiàn)了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(polymerase chain reaction，PCR)從定性到定量的飛躍，該技術(shù)利用PCR反應(yīng)體系中添加的特定熒光基團，實時監(jiān)測整個PCR進程中熒光信號的累積，從而對DNA、RNA樣品或者目標(biāo)基因的表達進行定量分析。具有重復(fù)性好、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、速度快等優(yōu)點［13-15］。本實驗研究了發(fā)酵期間不同釀酒酵母產(chǎn)EC能力的差異，同時利用熒光PCR技術(shù)對酵母中car1基因的表達活性進行了比較，以期為降低葡萄酒中EC含量，篩選適宜的釀酒酵母鑒定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 葡萄酒釀酒酵母

共18株釀酒酵母，其中13株來自本實驗室從新疆釀酒葡萄表皮分離的釀酒酵母，5株來自商業(yè)活性干酵母，18株供試酵母分別標(biāo)記為Y1～Y18。

赤霞珠葡萄汁:由豐收葡萄酒有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國PerkinElmer公司;安捷倫DBFFAP毛細(xì)管色譜柱(60m×0.25μm×0.25μm);strata FL-PR Florisil固相萃取柱，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;電泳儀，北京六一儀器廠;凝膠成像儀和PCR儀，美國Bio-Rad公司;7500fast熒光定量PCR儀，美國ABI公司;核酸定量儀，日本島津公司。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

氨基甲酸乙酯(EC)(純度＞99%)、內(nèi)標(biāo)物氨基甲酸丙酯(nPC)(純度 ＞98%，Sigma公司)。丙酮(色譜純)、二氯甲烷(分析純)、瓜氨酸(色譜純，百靈威)。瓊脂糖(Biowest Agarose)、EB(Sigma)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)、Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)、car1引物和ACTE引物(Life Technologies)、熒光定量8連管(Axygen)、RNase-free水(TakaRa)、RNase-free的槍頭和1.5 mL EP管(Axygen)。

1.2 分析方法

1.2.1 葡萄酒中EC含量的測定

采用 GC-MS 方法［16］。

1.2.2 精氨酸的測定方法

采用PITC柱前衍生高效液相色譜［17］。

1.2.3 釀酒酵母的活化

供試斜面酵母在10 mL滅菌后的麥汁中經(jīng)18 h活化后接種到裝有300 mL赤霞珠葡萄汁的三角瓶中;商業(yè)酵母在10 mL滅菌后的麥汁中活化30 min后接種到裝有300 mL赤霞珠葡萄汁的三角瓶中。然后在28℃下發(fā)酵5～8 d，每天稱重，連續(xù)2 d重量不變化發(fā)酵結(jié)束。

1.2.4 酵母RNA提取

在發(fā)酵過程中收集酵母菌體用液氮研磨成粉，加入1 mL Trizol試劑，按商品提供的操作手冊進行RNA提取，最后加入50 μL去RNA酶的雙蒸水溶解。

1.2.5 RNA濃度、純度檢測

利用BioSpec-nano nucleic acid analyzer檢測提取的總RNA濃度和純度。

1.2.6 RNA凝膠電泳檢測

先用1 mol/L NaOH浸泡電泳槽和制膠板1～2 h。配制1%瓊脂糖凝膠，總RNA上樣量1 μg左右。電壓200 V，電流400 mA、電泳時間30 min。

1.2.7 酵母RNA的反轉(zhuǎn)錄

使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為:37℃，15 min(逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng));85℃，5 s(失活逆轉(zhuǎn)錄酶);反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA溶液放置于-20℃保存?zhèn)溆没蛄⒓催M行熒光定量PCR。

1.2.8 熒光定量PCR

以酵母acte基因作為內(nèi)參，引物為:5'-CATGTTCCCAGGTATTGCCG-3’，5'-GCCAAAGCGGTGATTTCCT-3’;釀酒酵母精氨酸酶基因car1的引物為:

5'-TGGGTATCGCCGCCTTTT-3’，5'-GGGACTTCACCGTTTGTTTCT-3'

然后將反轉(zhuǎn)錄實驗獲得的cDNA溶液進行10倍稀釋，配制反應(yīng)液，在ABI 7500 Fast上進行Real Time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為:95℃，10 min，循環(huán)1次;95℃，15 s，60 ℃，40 s，循環(huán)40 次，并采集熒光。

1.2.9 car1基因相對表達量的計算

采用 Livak 和 Schmittgen(2001)［18］的2-ΔΔCT公式計算基因相對表達量，其中ΔΔCT=(CT，Target-CT，Acte)Time x-(CT，Target-CT，Acte)Time 0。CT，Target和CT，Acte分別是目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的CT值;Time x和Time 0分別指不同采樣時間點。分別以第1天采樣的樣本獲Y15酵母為參照，將其值轉(zhuǎn)換成1，其他樣品與之比較，即獲得相對表達值。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母發(fā)酵性能的比較研究

將18株釀酒酵母按照1.2.3的方法活化，然后接入裝有300 mL葡萄汁的三角瓶中，28℃下發(fā)酵，每天稱重。發(fā)酵曲線如圖1所示。

圖1 18種釀酒酵母發(fā)酵期間失重變化情況Fig.1 18 kinds of S.cerevisiae weightlessness during fermentation

從圖1可以看出，18種釀酒酵母發(fā)酵曲線基本相似，在發(fā)酵第2天，所有酵母均已起酵，第3天達到發(fā)酵高峰，隨后酵母的活性逐漸降低，第7～8天發(fā)酵基本停止。但從起酵速度和發(fā)酵速度兩方面來講，不同酵母間又存在顯著差異，本實驗室分離的釀酒酵母Y4、Y5、Y7、Y15的起酵速度最快，甚至高于5種商業(yè)酵母;而失重最多的酵母分別為Y5、Y4和商業(yè)酵母Y15。

對發(fā)酵結(jié)束的葡萄酒進行理化指標(biāo)的檢測，檢測方法參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15038，具體結(jié)果見表1。

表1 不同酵母發(fā)酵葡萄酒基本理化指標(biāo)Table 1 The physical and chemical indicators of different S.cerevisiae ferment in wine

由表1看出，不同酵母發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒的酒精度存在差異，酒精度最高的酵母依次為Y5、Y4和Y15，與發(fā)酵期間的失重量正好對應(yīng)。而其余酵母發(fā)酵后的理化指標(biāo)也滿足葡萄酒國家標(biāo)準(zhǔn)的各項要求，均可以進行工業(yè)化的生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2 釀酒酵母代謝產(chǎn)生尿素和EC能力的分析研究

目前，大多數(shù)研究認(rèn)為，酵母菌是影響葡萄酒中EC含量的主要微生物，因為不同酵母菌分泌和代謝尿素的能力不同，本研究在其他發(fā)酵條件均相同的條件下，研究了不同酵母菌對發(fā)酵期間精氨酸含量的變化，以發(fā)酵性能比較好的Y4、Y5、Y15和Y8酵母為例，發(fā)酵期間精氨酸的變化趨勢如圖2所示。

尿素為葡萄酒中EC形成的主要前體物質(zhì)，是發(fā)酵過程中精氨酸代謝的副產(chǎn)物。從圖2可以看出，精氨酸含量在發(fā)酵期間的變化規(guī)律基本相似，均呈現(xiàn)指數(shù)下降趨勢，即呈現(xiàn)一級動力學(xué)反應(yīng)特點，發(fā)酵開始精氨酸含量下降迅速，而后期逐漸減緩。但酵母類型不同，反應(yīng)速率存在顯著差異，圖2中的4種酵母，Y15的速率最大，其次為Y5、Y4和Y8。

圖2 四種不同類型的酵母發(fā)酵期間精氨酸含量的變化Fig.2 The change of arginine during the fermentation，which is ferment from 4 kind of S.cerevisiae

2.3 釀酒酵母car1基因表達量的分析

在葡萄酒釀造過程中，酵母降解精氨酸生成尿素和鳥氨酸，該過程受car1基因編碼的精氨酸酶活性的影響。由基因car1編碼的精氨酸酶代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，car1基因表達量越多，尿素的積累量越大，產(chǎn)生的EC也就越多。因此控制精氨酸酶的基因car1的表達量是降低葡萄酒中EC含量的關(guān)鍵。所以篩選低產(chǎn)尿素的酵母，即car1基因表達量低的酵母是降低葡萄酒中EC含量的關(guān)鍵因素。

2.3.1 RNA樣品的質(zhì)量檢測

本研究利用紫外分光光度計對從酵母細(xì)胞中提取的RNA的OD值進行測定，結(jié)果如表2所示。

表2 不同酵母細(xì)胞RNA的OD值Table 2 The OD value of different S.cerevisiae cell RNA

表3結(jié)果顯示，將酵母總RNA樣品進行紫外分析測定，18種釀酒酵母的RNA OD260/280基本在2.0左右，說明樣品中沒有其他小分子物質(zhì)的污染。凝膠電泳檢測結(jié)果表明:用本方法提取的總RNA樣品28S、18S的帶型整齊清楚(圖3)，這一結(jié)果說明，用本方法提取的釀酒酵母總RNA完整性較好，沒有出現(xiàn)降解。因此，用本方法提取的酵母總RNA樣品純度較高?？俁NA濃度在853.4～1 576.1 ng/μL。后續(xù)的RT-PCR擴增試驗的結(jié)果證實，本方法提取的酵母總RNA的質(zhì)量較高、完整性好，能滿足多數(shù)分子生物學(xué)試驗要求。

圖3 酵母總RNA電泳結(jié)果Fig.3 Total RNA electrophoresis results of S.cerevisiae

圖4 目的基因的擴增曲線和溶解曲線Fig.4 Amplification curve and dissolution curve of purpose gene

以不同酵母的cDNA為模板，每組設(shè)3個重復(fù)，經(jīng)Real-timePCR后，擴增曲線的走勢正常，拐點清楚，整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象，并且溶解曲線的峰值單一(圖4、圖5)，說明引物具有高度特異性，沒有非特異性產(chǎn)物擴增。

圖5 內(nèi)參基因的擴增曲線和溶解曲線Fig.5 Amplification curve and dissolution curve of Internal gene

2.3.2 酵母car1基因在酒精發(fā)酵期間不同階段的表達

圖2結(jié)果顯示，不同酵母發(fā)酵的發(fā)酵液中精氨酸含量均呈下降趨勢，由于car1基因可代謝精氨酸產(chǎn)生尿素，因此本研究分析了發(fā)酵期間不同酵母car1基因的表達情況，以發(fā)酵初始酵母為對照，結(jié)果如圖6所示。

圖6 Y4、Y5酵母在發(fā)酵期間car1基因的表達Fig.6 The Y4，Y5 S.cerevisiaestrains expression level of car1 gene during fermentation

圖6結(jié)果說明，2種不同的釀酒酵母在發(fā)酵期間，car1基因均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，本實驗中，發(fā)酵第2天基因的相對表達量最高，Y4、Y5酵母分別為發(fā)酵開始時基因表達量的2.67和2.90倍，比較而言，此時Y5酵母代謝精氨酸的能力更強，這正好與2個樣品精氨酸的含量相一致(Y4、Y5酵母發(fā)酵第2天精氨酸含量分別為16.778和16.293)。比較圖1和圖6的變化情況發(fā)現(xiàn)，酵母的發(fā)酵曲線與car1的基因表達也基本相似，圖1中發(fā)酵第3天達到高峰，此后趨勢逐漸減緩，這也說明了酵母的活性直接影響基因的表達情況，生產(chǎn)中降低酵母活性的措施在一定程度上也能抑制基因的表達量。

取發(fā)酵第2天的發(fā)酵液和酵母，分別檢測發(fā)酵液中的EC含量和酵母中car1基因的表達量，結(jié)果如圖7所示。不同酵母由于car1基因表達情況不同，造成葡萄酒酵母代謝精氨酸以及產(chǎn)生尿素的能力不同，直接影響到發(fā)酵液中的EC含量。本研究中產(chǎn)EC最高的是Y14酵母，發(fā)酵第2天的EC含量為1.58 ng/L，而Y18酵母產(chǎn)量最低，僅為0.23 ng/L，差異達到了極顯著水平;結(jié)合圖2、圖6和圖7的結(jié)果，酵母car1基因的表達量與發(fā)酵液中的精氨酸呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.990 3～0.997 7之間，達到了極顯著水平;而car1基因的表達量與EC含量呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.624 9～0.995 8之間，釀酒酵母car1基因的表達量與發(fā)酵液中的EC含量基本一致，所以葡萄酒酵母代謝精氨酸以及尿素的分泌具有菌株特異性，不同酵母精氨酸代謝能力存在顯著差異。

3 討論

圖7 18種不同釀酒酵母EC含量與基因表達量的關(guān)系Fig.7 The correlation between the 18 S.cerevisiae strains content of EC and amount of gene expression

本研究結(jié)果表明，釀酒酵母car1基因的活性在發(fā)酵期間呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，不僅與發(fā)酵醪液中精氨酸的變化趨勢基本一致，而且與酵母自身的繁殖情況也相同，因此降低發(fā)酵溫度和酵母接種量等影響酵母活性的措施也將會通過影響car1基因活性，進而影響到葡萄酒中的EC濃度。本研究分析的18株釀酒酵母，Y18酵母產(chǎn)EC能力最低，而Y14酵母最高，不同酵母間存在顯著差異，在其他發(fā)酵參數(shù)均相同的條件下，酵母car1基因的表達量與該酵母發(fā)酵后葡萄酒中的EC含量也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，因此篩選精氨酸酶活力低的酵母菌株，是降低葡萄酒中EC含量的主要措施之一。

尿素作為影響葡萄酒中EC含量的關(guān)鍵因素之一，在葡萄酒酒精發(fā)酵過程中，其形成主要來自于精氨酸降解。即在較好氮源缺乏的情況下，精氨酸會在精氨酸酶的作用下分解為尿素和瓜氨酸，精氨酸酶作為尿素形成的一個關(guān)鍵酶，主要是由 car1編碼。1990年釀酒酵母中的精氨酸酶基因被首次敲除，研究者通過小規(guī)模發(fā)酵試驗觀察到野生型菌株和精氨酸酶基因敲除菌株之間的二氧化碳排放量相差不大，這表明精氨酸酶基因敲除后不影響釀酒酵母的發(fā)酵性能［19］。但后期研究表明使用精氨酸酶基因缺陷型菌株進行發(fā)酵容易受到野生型酵母菌株的污染［20］，而且基因手段構(gòu)建的酵母菌株的安全性問題仍無定論，目前基因工程菌在工業(yè)化生產(chǎn)中是不建議使用的，因此了解car1基因在酵母發(fā)酵過程中的表達特點，篩選car1活性低的釀酒酵母具有重要意義。目前，我國葡萄酒領(lǐng)域有關(guān)該基因的表達研究極為少見，本研究對釀酒酵母car1基因在發(fā)酵過程中的表達分析結(jié)果，對進一步探討該基因?qū)ζ咸丫艵C含量的影響方面的作用具有重要參考價值。

［1］ Fleet G H.Wine yeast for the future［J］.FEMS Yeast Research，2008，8(7):979-995.

［2］ Beland F A，Wayne B R，Mellick P W，et al.Effect of ethanol on the tumorigenicity of urethane(ethyl carbamate)in B6C3F1 mice ［J］.Food and Chemical Toxicology，2005，43(4):1-19.

［3］ Miller Y E，Dwyer-Nield，Keith R L，et al.Induction of a high incidence of lung tumors in C57BL/6mice with multiple ethyl carbamate injection ［J］.Cancer Letters，2003，198(4):139-144.

［4］ Lachenmeier D R，Kanteres F，Kuballa T，et al.Ethyl carbamate in alcoholic beverages from Mexio(tequila，mescal，stool)and Guatemala(cuxa):Market survey and risk assessment［J］.International Journal of Environmental Research and Public health，2009，6(1):349-360.

［5］ Delledonne D，Rivetti F，Romano U.Developments in the production and application of dimethylcarbonate［J］.Applied Catalysis A:General，2001，221(1-2):241-251.

［6］ WANG D，YANG B，ZHAI X，et al.Synthesis of diethyl carbonate by catalytic alcoholysis of urea［J］.Fuel Process Technology，2007，88(8):807-812.

［7］ Azevedo Z，Couto J A，Hogg T.Citrulline as the main precursor of ethyl carbamate in model fortified wines inoculated with Lactobacillus hilgardii:a marker of the levels in a spoiled fortified wine［J］.Letters in Applied Microbiology，2002，34(1):32-36.

［8］ Arena M E，Manca de Nadra M C.Influence of ethanol and low pH on arginine and citrullinemetabolism in lactic acid bacteria from wine ［J］.Research in Microbiology，2005，156(8):858-864.

［9］ 梁萌萌，薛潔，張敬，等.葡萄酒中氨基甲酸乙酯的分析與控制［J］.釀酒科技，2013，225(3):40-43.

［10］ Uthurry C A，Varela F，Colomo B.Ethyl carbamate concentrations of typical Spanish red wines［J］.Food Chemistry，2004，88(3):329-336.

［11］ Uthurry C A，Suárez Lepe J A.Ethyl carbamate production by selected yeasts and lactic acid bacteria in red wine［J］.Food Chemistry，2006，94(2):262-270.

［12］ Suizu T，Limura Y，Gomi K，et al.Construction of urea non-producing yeast Saccharomyces cerevisiae by disruption of the car1 gene［J］.Agric Biol Chem，1990，54(2):537-539.

［13］ Haller F，Kulle B，Schwager S，et al.Equivalence test in quantitative reverse transcription polymerase chain reaction:confirmation of reference genes suitable for normalization［J］.Analytical Biochemistry，2004，335(1):1-9.

［14］ Ransbotyn V，Reusch T B H.Housekeeping gene selection for quantitative real-time PCR assays in the seagrass Zostera marina subjected to heat stress［J］.Limnology and O-ceanography:Methods，2006，4(5):367-373.

［15］ Yoo W G，Kim T I，LI S，et al.Reference genes for quantitative analysis on clonorchis sinensis gene expression by real-time PCR［J］.Parasitol Research，2009，104(2):321-328.

［16］ 付方圓，薛潔，梁萌萌，等.葡萄酒貯存過程中氨基甲酸乙酯含量的變化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(8):34-39.

［17］ 楊菁，孫黎光，白秀珍.異硫氰酸苯酯柱前衍生化反相高效液相色譜法同時測定18種氨基酸［J］.色譜，2002，20(4):369-370.

［18］ Livak K J，Schmittgen，T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method［J］.Method，2001，25(4):402-408.

［19］ Suizu T，Iimura Y，Gomi K，et al.Construction of urea non-producing yeast Saccharomyces cerevisiae by disruption of the car1 gene ［J］.Agriculture Biological Chemistry，1990，54(2):537-539.

［20］ Yoshiuchi K，Watanabe M，Nishimura A.Breeding of a non-urea producing sake yeast with killer character using a kar1-1 mutant as a killer donor［J］.Journal of Industrial Microbiology ＆ Biotechnology，2000，24(3):203-209.