李子杰，賀貝貝，高曉冬

(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

醛縮酶介導(dǎo)的羥醛縮合反應(yīng)是合成手性C-C鍵的最重要方法之一［1-3］。對(duì)于醛縮酶來(lái)說(shuō)，磷酸二羥基丙酮(DHAP)依賴型醛縮酶研究最為廣泛。該類醛縮酶催化DHAP供體分子與醛受體分子的羥醛縮合反應(yīng)，醛縮酶能夠決定產(chǎn)物中兩個(gè)新生成的立體中心的構(gòu)型［4］，并且不受底物的結(jié)構(gòu)或立體化學(xué)的影響［5］。D-果糖-1，6-二磷酸醛縮酶(FruA)活性高、能夠以多種醛作為受體，是應(yīng)用最為廣泛的DHAP依賴型醛縮酶。FruA對(duì)DHAP分子的專一性要求非常高［6］，由于DHAP成本昂貴并且穩(wěn)定性較差，不利于產(chǎn)物的大量制備［6-8］。

在前期工作中，基于“一釜四酶法”的策略，以外消旋的DL-3-磷酸甘油作為起始底物在磷酸甘油氧化酶的作用下生成DHAP，同時(shí)與FruAS.car醛縮酶(Staphylococcus carnosus來(lái)源)催化的羥醛縮合反應(yīng)偶聯(lián)，制備了多種酮糖［9］。雖然能夠避免直接使用DHAP，在一定程度上節(jié)約了成本，但沒(méi)能從根本上實(shí)現(xiàn)DHAP的大量合成問(wèn)題。在本研究中，以便宜的底物葡萄糖作為碳源，通過(guò)糖酵解途徑在同時(shí)表達(dá)FruAS.car醛縮酶和YqaB磷酸酶大腸桿菌工程菌胞內(nèi)產(chǎn)生DHAP，并分別在培養(yǎng)基中添加醛受體丙醛、丁醛合成相應(yīng)的稀有酮糖。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

CDFDuet-1質(zhì)粒和大腸桿菌BL21Star(DE3)，Novagen公司;pKK-fda質(zhì)粒由Fessner教授提供;大腸桿菌MG1655和DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存;用于基因擴(kuò)增的引物在上海生工合成(表1)。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2 酶、試劑和培養(yǎng)基

DNA聚合酶從Invitrogen公司購(gòu)買;限制性內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)于寶生物公司;鏈霉素、M9無(wú)機(jī)鹽、鹽酸硫胺素購(gòu)自 Sigma-Aldrich;硅膠購(gòu)自 EMD Chemicals公司。

LB液體培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，121℃濕熱滅菌20 min;M9培養(yǎng)基(g/L):Na2HPO46，KH2PO43，NaCl 0.5，NH4Cl 1，MgSO40.12，CaCl20.011 1，硫胺素0.001，ZnSO40.003 2。

1.3 CDF-fda-yqaB重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pKKfda為模板，使用CDF-fda-F和CDF-fda-R分別作為上下游引物通過(guò)PCR擴(kuò)增基因fda;以大腸桿菌MG1655為模板，以CDF-yqaB-F和CDF-yqaB-R分別作為上下游引物擴(kuò)增基因yqaB;使用限制性內(nèi)切酶BamHI，PstI分別對(duì)fda基因片段和CDFDuet-1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒CDF-fda;使用限制性內(nèi)切酶NdeI，XhoI分別對(duì)yqaB片段以及質(zhì)粒CDF-fda進(jìn)行雙酶切，連接、轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，得到重組質(zhì)粒CDF-fda-yqaB。

1.4 稀有酮糖的制備

表達(dá)質(zhì)粒CDF-fda-yqaB轉(zhuǎn)化BL21Star(DE3)感受態(tài)細(xì)胞得到BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB重組菌株。將LB培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)的該重組菌株的培養(yǎng)液以1∶50的比例轉(zhuǎn)接到以5 g/L葡萄糖為碳源、鏈霉素終濃度為100 μg/mL的M9培養(yǎng)基中(2 L)，在37℃，225 r/min條件下培養(yǎng)。當(dāng)測(cè)得菌液OD600為0.8～1.0時(shí)，調(diào)整溫度為30℃后，加入過(guò)濾滅菌終濃度為1 mmol/L的IPTG。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)2-3 h后，加入終濃度為30 mmol/L丙醛(過(guò)濾除菌)。在發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)葡萄糖或丙醛的量不足時(shí)，適當(dāng)補(bǔ)加，并用NaOH溶液來(lái)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH，使其維持在7.0左右。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加丁醛作為醛受體(加入丁醛的終濃度為40 mmol/L)，發(fā)酵流程參考丙醛為醛受體的發(fā)酵。當(dāng)產(chǎn)物的量沒(méi)有顯著增加時(shí)，結(jié)束發(fā)酵，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程約為40 h。

1.5 稀有酮糖的分離和純化

發(fā)酵結(jié)束后對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心(4 000 g，20 min，4℃)，將上清液轉(zhuǎn)移到燒瓶中進(jìn)行減壓濃縮。濃縮產(chǎn)物用硅膠純化，流動(dòng)相為二氯甲烷∶甲醇為20∶1(v/v)，流出液按照先后順序進(jìn)行依次收集，首先初步判定目的產(chǎn)物位于哪些離心管中，然后以二氯甲烷∶甲醇20∶1(v/v)為展開(kāi)劑并以體外合成的相應(yīng)酮糖產(chǎn)物作為對(duì)照，通過(guò)TLC檢測(cè)來(lái)確定含有目的產(chǎn)物的洗脫液。收集目標(biāo)洗脫液，濃縮、干燥、稱重，用1H-NMR檢測(cè)純度。

1.6 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

將過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液以1/50的比例轉(zhuǎn)接到以5 g/L13C全標(biāo)記葡萄糖作為碳源，鏈霉素終濃度為100 μg/mL的M9培養(yǎng)基中(100 mL)。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程參照1.4。當(dāng)葡萄糖利用完全且產(chǎn)物的量沒(méi)有顯著變化時(shí)終止發(fā)酵。產(chǎn)物的分離純化參照1.5，并用13C NMR檢測(cè)。

1.7 分析方法

HPLC檢測(cè)條件如下:色譜柱型號(hào)為 Bio-Rad HPX-87H(300 mm×7.8 mm，氫型陽(yáng)離子交換柱)，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.5 mL/min，柱溫為60℃，示差檢測(cè)器檢測(cè)。

2 結(jié)果和討論

2.1 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒CDF-fda-yqaB

首先驗(yàn)證重組質(zhì)粒CDF-fda是否構(gòu)建成功，通過(guò)BamHI，PstI雙酶切能夠檢測(cè)到fda基因(888 bp)大小的片段(圖1-a)，表明fda基因片段已經(jīng)插入到CDFDuet-1質(zhì)粒中并對(duì)fda基因進(jìn)行測(cè)序。為了驗(yàn)證表達(dá)質(zhì)粒CDF-fda-yqaB是否構(gòu)建成功，經(jīng)過(guò)BamHI，XhoI雙酶切能夠檢測(cè)到大約1 600 bp大小的片段(圖1-b)，根據(jù)基因fda和yqaB的大小，可以推斷yqaB基因已經(jīng)成功插入到質(zhì)粒CDF-fda并進(jìn)一步對(duì)yqaB基因進(jìn)行測(cè)序。

圖1 重組質(zhì)粒CDF-fda-yqaB的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant plasmid CDF-fda-yqaB

2.2 醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB在大腸桿菌中的表達(dá)

使用重組表達(dá)質(zhì)粒CDF-fda-yqaB在大腸桿菌BL21Star(DE3)同時(shí)過(guò)量表達(dá)醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB。理論上，F(xiàn)ruAS.car和YqaB蛋白的分子質(zhì)量分別為32.855 kDa和20.78 kDa。從SDS-PAGE圖來(lái)看(圖2)，這兩種蛋白的大小基本上與理論值一致，從而說(shuō)明醛縮酶FruAS.car和磷酸酶YqaB成功得到了表達(dá)。

2.3 以丙醛(丁醛)為醛受體發(fā)酵制備稀有酮糖

圖2 SDS-PAGE檢測(cè)FruAS.car和YqaB的表達(dá)Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression of FruAS.carand YqaB

在前期體外實(shí)驗(yàn)中，利用醛縮酶FruAS.car分別以丙醛、丁醛等受體合成了D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖、D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖等稀有酮糖［9］。在體外實(shí)驗(yàn)中，酸性磷酸酶(AP)常用來(lái)脫磷酸化得到相應(yīng)酮糖［9］，由于AP的最適pH偏酸性，不適合在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的脫磷酸化。通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于大腸桿菌的磷酸酶YqaB在中性pH(生理?xiàng)l件下)具有較強(qiáng)的磷酸酶活性［10］。首先在體外實(shí)驗(yàn)中研究YqaB磷酸酶對(duì)底物D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖 1-磷酸的脫磷酸化作用，通過(guò)TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該磷酸酶可以脫掉相應(yīng)酮糖-1-磷酸的磷酸基團(tuán)得到相應(yīng)的酮糖(未顯示結(jié)果)。為了在大腸桿菌合成如上兩種稀有酮糖，以BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB作為發(fā)酵菌株，以廉價(jià)的葡萄糖作為碳源，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛、丁醛作為醛受體，進(jìn)行相應(yīng)酮糖的合成。為了檢測(cè)是否有目標(biāo)酮糖產(chǎn)物的生成，對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行HPLC檢測(cè)，并分別以體外合成純化的兩種稀有酮糖作為對(duì)照。由圖3可以看到，D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖能夠被檢測(cè)到(如箭頭所示);由圖4可以看到，D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖能夠被檢測(cè)到(如箭頭所示)。從而說(shuō)明分別以丙醛、丁醛為受體，能夠分別在大腸桿菌中合成相應(yīng)的稀有酮糖。

當(dāng)在培養(yǎng)基中添加丙醛作為醛受體，對(duì)于2 L的發(fā)酵，發(fā)酵上清液經(jīng)過(guò)硅膠純化，能夠制備D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖(300 mg);當(dāng)在培養(yǎng)基中添加丁醛作為醛受體(2 L)，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)純化，能夠制備D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖(321 mg)。純化后的酮糖產(chǎn)物用1H NMR進(jìn)行確認(rèn)，如圖5所示?？傮w上來(lái)說(shuō)，以丙醛、丁醛為醛受體的發(fā)酵，分離純化后得到相應(yīng)稀有酮糖的產(chǎn)量比較低，分析其可能的原因如下:由FruAS.car醛縮酶體外合成實(shí)驗(yàn)可以推斷，和D-甘油醛相比，F(xiàn)ruAS.car醛縮酶對(duì)丙醛、丁醛的活性比較低;YqaB磷酸酶對(duì)D-果糖-1-磷酸具有較高的磷酸酶活性，而對(duì) D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖-1-磷酸和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖-1-磷酸脫磷酸基團(tuán)的活性比較低;丙醛、丁醛對(duì)大腸桿菌菌體生長(zhǎng)具有抑制作用。為了提高產(chǎn)量，一方面對(duì)調(diào)節(jié)DHAP合成的上游基因過(guò)量表達(dá)，同時(shí)敲除DHAP的代謝支路在胞內(nèi)積累DHAP的量;另一方面對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，比如優(yōu)化丙醛、丁醛加入的量等。

圖3 HPLC檢測(cè)在大腸桿菌中合成D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖Fig.3 HPLC analysis of the production of 5，6-dideoxy-D-threo-2-hexulose in E.coli

圖4 HPLC檢測(cè)在大腸桿菌中合成D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖Fig.4 HPLC analysis of the production of 5，6，7-trideoxy-D-threo-heptulose

2.4 同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)羥醛縮合反應(yīng)得到的稀有酮糖包含兩部分，第1，2，3位的碳原子來(lái)源于供體DHAP，其余碳原子來(lái)源于醛受體。為了證實(shí)產(chǎn)物從DHAP而來(lái)的3個(gè)碳原子最終從葡萄糖而來(lái)，以BL21Star(DE3)/CDF-fda-yqaB作為工程菌，以13C同位素全標(biāo)記的葡萄糖作為唯一碳源并在培養(yǎng)基中添加丙醛進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)過(guò)分離純化得到 D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖(25 mg)。通過(guò)對(duì)酮糖產(chǎn)物進(jìn)行13C NMR分析檢測(cè)，可以得知產(chǎn)物的1位碳對(duì)應(yīng)著位于65 ppm位置的峰，產(chǎn)物的2位碳對(duì)應(yīng)著位于210 ppm位置的峰，產(chǎn)物的3位碳對(duì)應(yīng)著76 ppm位置的峰(圖6)，從而證明推斷。

圖5 純化后產(chǎn)物1H NMR鑒定Fig.5 Characterization of products afterpurification by1H NMR

圖6 13C NMR分析同位素標(biāo)記的產(chǎn)物Fig.6 13C NMR analysis of the product from the isotope experiment

3 結(jié)論

以過(guò)量表達(dá)FruAS.car醛縮酶和YqaB磷酸酶的大腸桿菌工程菌作為發(fā)酵菌株，以便宜的葡萄糖為碳源，通過(guò)糖酵解途徑在胞內(nèi)產(chǎn)生DHAP，分別在培養(yǎng)基中添加丙醛或丁醛作為受體，進(jìn)行了相應(yīng)稀有酮糖D-蘇式-5，6-二脫氧-2-己酮糖和 D-蘇式-5，6，7-三脫氧-2-庚酮糖的合成，從而成功地將FruA醛縮酶催化的羥醛縮合反應(yīng)在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)。具有重要意義的是在磷酸酶YqaB作用下，羥醛縮合產(chǎn)物能夠在胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)脫磷酸生成沒(méi)有磷酸基團(tuán)的酮糖，有利于產(chǎn)物穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入到胞外，便于分離和純化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了磷酸基團(tuán)在胞內(nèi)的再次利用。然而由于酮糖產(chǎn)量相對(duì)較低，擬采用分子生物學(xué)的方法提高胞內(nèi)DHAP水平和優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)提高產(chǎn)量。此外，同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了酮糖產(chǎn)物從DHAP而來(lái)的3個(gè)碳原子最終是從葡萄糖而來(lái)。

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