宋海燕，何文輝，張澤華，袁榮榮

(上海海洋大學(xué)省部共建水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海，201306)

鹿角菜(Pelvetia siliquosa Tsenget C.F.Chang)隸屬褐藻門(Phaeophyta)、圓子綱(Cyclosporeae)、鹿角菜目(Fucales)、鹿角菜科(Fucaceae)、鹿角菜屬(Pelvetia)［1］。鹿角菜藻體骨小，軟骨質(zhì)，叉狀分枝角度較寬，生長(zhǎng)托是長(zhǎng)角果形［2］。巖藻多糖是褐藻中重要的雜多糖，其主要單糖組成是L-巖藻糖，是一種硫酸多糖。

多糖提取的常用方法有熱水提取、超聲輔助提取和微波輔助提取法，其中選用超聲波輔助提取是因?yàn)槠淠芎牡?、溶劑消耗低、提取效率較高以及自動(dòng)化程度高［3-4］。當(dāng)今，優(yōu)化提取工藝以獲得最大多糖提取率已成為研究熱點(diǎn)［5-8］。Box-Benhnken設(shè)計(jì)(BBD)是一個(gè)球形旋轉(zhuǎn)設(shè)計(jì)，與傳統(tǒng)方法相比，簡(jiǎn)化了需要評(píng)估多個(gè)變量和它們之間的相互作用試驗(yàn)的復(fù)雜性，已被廣泛應(yīng)用于優(yōu)化提取工藝，獲得最佳多糖提取率的最佳工藝參數(shù)組合［9-11］。

本試驗(yàn)以鹿角菜為原材料，采用超聲波輔助提取鹿角菜中巖藻多糖，通過(guò)響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化提取工藝，同時(shí)采用自由基清除能力體系來(lái)對(duì)巖藻多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

鹿角菜(Pelvetia siliquosa Tsenget C.F.Chang)產(chǎn)自海南，已在試驗(yàn)室人工飼養(yǎng);L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品(Fuc)，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;重蒸酚，生工生物工程(上海)股份有限公司。無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、濃 H2SO4、三氯甲烷、正丁醇、K3Fe(CN)6、三氯乙酸、FeCl3、DPPH、抗壞血酸(Vc)、水楊酸、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷(Tris)等均為分析純。

JY92-2D超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝科器研究所;SP-722可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司;SXT-06索氏提取器，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司;LXJ-IIB低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;美國(guó)LABCONCO冷凍干燥機(jī)，無(wú)錫凱派克斯科技有限公司;R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申勝生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 巖藻多糖提取工藝研究

鹿角菜洗凈晾干，-80℃預(yù)凍24 h，冷凍干燥24 h，研磨粉碎過(guò)60目篩，用95%乙醇90℃回流脫脂3次，每次4 h，40℃烘干得脫脂藻粉。

脫脂藻粉加入適量蒸餾水溶脹，超聲波輔助提取后，水浴處理一段時(shí)間，提取液冷卻至室溫，4 000 r/min離心20 min后，棄沉淀，濃縮上清液至1/5體積，冷卻后加無(wú)水乙醇至濃度為30%，以除去褐藻膠，靜置1 h，4 000 r/min離心20 min，濃縮上清液至1/5體積，加4倍體積95%乙醇，4℃靜置過(guò)夜，4 000 r/min離心，收集沉淀，用無(wú)水乙醇洗滌數(shù)次，冷凍干燥得粗巖藻多糖。

1.2.2 巖藻多糖含量的測(cè)定

制備標(biāo)準(zhǔn)曲線［12］:取 L-巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，加蒸餾水至 2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，混勻后，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置5 min，沸水浴加熱20 min后，冷卻至室溫。490 nm處測(cè)吸光度，以L-巖藻糖的濃度(c，mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為:Y=0.0198 c+0.052 7，R2=0.997 6。

樣品溶液的制備:取1 mL樣品溶液，置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再加入6%苯酚1.0 mL，混勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置5 min，沸水浴加熱20 min后，冷卻至室溫。490 nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算粗巖藻多糖提取率［公式(1)］。

1.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲時(shí)間、料液比、水浴溫度以及水浴時(shí)間4因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。響應(yīng)面因素水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Analytical factors and levels for RSM

1.4 粗巖藻多糖初步處理

配制2%的粗巖藻多糖溶液，并加入1/3糖溶液體積的 Sevag試劑［V(氯仿)∶V(正丁醇)=5∶1］，劇烈振蕩30 min，離心5 000 r/min，10 min，上層水相含多糖，下層為有機(jī)相，去除有機(jī)相層和蛋白質(zhì)沉淀層，水相按照此方法反復(fù)除蛋白至兩相間沒(méi)有白色蛋白質(zhì)。將脫蛋白后的多糖溶于蒸餾水，借助磁力攪拌，連續(xù)透析24 h，每4換水。濃縮后冷凍干燥得初純巖藻多糖(F)。

1.5 巖藻多糖抗氧化活性試驗(yàn)

1.5.1 巖藻多糖的羥自由基(·OH)清除能力測(cè)定

雙氧水與二價(jià)鐵發(fā)生Fenton反應(yīng)生成羥自由基，加入巖藻多糖后會(huì)和水楊酸競(jìng)爭(zhēng)與羥自由基的結(jié)合，從而使有色產(chǎn)物減少，該產(chǎn)物在510 nm處吸收值最大，可以采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定510 nm處的吸光值來(lái)評(píng)定。

根據(jù)孫海森的方法［13］，將巖藻多糖稀釋成不同濃度梯度:0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。取6 mmol/L水楊酸，2 mmol/L 的 FeS04各1 mL，搖勻，再加入1 mL的 6 mmol/L H2O2，搖勻，于37℃水浴恒溫15 min后，測(cè)定其吸光度A0。之后，各加入巖藻多糖溶液1 mL，搖勻，放置10 min，測(cè)定其吸光度A1，并用水代替H2O2的A2做參照，按公式(2)計(jì)算清除率。同時(shí)以相同濃度的Vc作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

式中:A0為空白對(duì)照的吸光值;A2為多糖本底吸光值;A1為巖藻多糖樣品的吸光值。

1.5.2 巖藻多糖的超氧陰離子自由基(O2-·)清除能力測(cè)定

堿性條件下，鄰苯三酚經(jīng)自氧化產(chǎn)生中間產(chǎn)物O2-·，它會(huì)加速鄰苯三酚的自氧化反應(yīng)。參照婁翠的方法［14］，分別將巖藻多糖和Vc配成不同質(zhì)量濃度梯度:0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL。取 5 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.2，50 mmol/L)，25 ℃預(yù)熱30 min，加入2 mL不同質(zhì)量濃度的多糖溶液和Vc溶液，25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.6 mL，混合均勻后在25℃的水浴條件下反應(yīng)10 min，再加入8 mol/L的HCl溶液3 mL來(lái)終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水為對(duì)照。O2-·的清除能力按公式(3)計(jì)算:

式中:A0、A1、Ai分別為空白對(duì)照、巖藻多糖樣品、不加鄰苯三酚溶液的吸光度值。

1.5.3 DPPH法測(cè)定巖藻多糖的抗氧化能力

參考郭欣的測(cè)定方法［15］，取1 mL不同質(zhì)量濃度梯度樣品溶液(0.05，0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mg/mL)，0.2 mL DPPH溶液，以及2 mL蒸餾水，混勻，常溫下30 min后，在515 nm出測(cè)定吸光度A1，用蒸餾水代替樣品得到吸光度A0，無(wú)水乙醇代替樣品得到吸光度A2［公式(4)］。同時(shí)以相同濃度的Vc作為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.5.4 巖藻多糖的還原力測(cè)定

采用Amarowicz方法［16］，并稍做調(diào)整。取pH 6.6的0.2 mmol/L磷酸鈉緩沖液和1%的鐵氰化鉀溶液各2.5 mL，加入不同質(zhì)量濃度梯度的樣品溶液(0.05，0.2，0.8，1.0，2.0，4.0 mg/mL)1 mL，混勻后50 ℃水浴20 min。加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL，混勻，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入蒸餾水2.5 mL，再加入0.1%FeCl32.5 mL，混勻，在避光處?kù)o置10 min后于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用Box-Benhnken設(shè)計(jì)對(duì)巖藻多糖提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析，響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design and experimental results of RSM

2.2 數(shù)學(xué)模型建立與數(shù)據(jù)分析

利用Design Expert8.05軟件對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到巖藻多糖提取率(Y)對(duì)試驗(yàn)因素的二次回歸方程如下所示:

Y=-141.130 78+1.715 42A+0.614 08B+1.352 44C+7.511 35D+6.481 50×10-4AB-2.374 00×10-4AC-0.011 364AD-1.109 00×10-3BC-5.702 75×10-3BD-9.595 00×10-4CD-0.013 969A2-5.145 13×10-3B2-7.033 04×10-3C2-0.648 38D2

二次回歸方程中，A2、B2、C2、D2的系數(shù)均為負(fù)數(shù)，因而推斷回歸方程所對(duì)應(yīng)的拋物面開(kāi)口向下，說(shuō)明有極大值點(diǎn)。由表3可知，回歸模型項(xiàng)P＜0.000 1，說(shuō)明該回歸模型極顯著，且模型失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.155 3＞0.05)，說(shuō)明未知因素對(duì)該試驗(yàn)結(jié)果干擾小。決定系數(shù)R2=0.978 6，說(shuō)明該二次回歸模型與實(shí)際試驗(yàn)值擬合度較好且可靠性高。調(diào)整系數(shù)，說(shuō)明該二次回歸模型可以解釋95.55%的響應(yīng)值的變化。變異系數(shù)(C.V.%=3.71)有較低值，說(shuō)明試驗(yàn)值可靠。信噪比(Adeq Precision)為18.552，說(shuō)明精度很高。該回歸方程模型擬合較好，可用于巖藻多糖的超聲輔助提取工藝優(yōu)化。

一次項(xiàng)中 A、B、C和 D均為差異極顯著(P＜0.001)，說(shuō)明在巖藻多糖提取工藝過(guò)程中，超聲時(shí)間、液料比、水浴溫度和水浴時(shí)間對(duì)巖藻多糖的提取有極其顯著的影響，是巖藻多糖提取率的主要限制因子;由表3可以得出影響鹿角菜巖藻多糖提取率的順序依次為超聲時(shí)間(A)＞水浴溫度(C)＞水浴時(shí)間(D)＞液料比(B)。

2.3 響應(yīng)面三維圖分析

圖1顯示了水浴溫度和水浴時(shí)間在中心水平時(shí)，超聲時(shí)間和液料比對(duì)超聲輔助提取巖藻多糖提取率的影響。當(dāng)超聲時(shí)間在50～60 min范圍，液料比在40～50(mL∶g)范圍內(nèi)，多糖提取率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，液料比的增加而不斷提高，當(dāng)超聲時(shí)間和液料比超過(guò)中心水平時(shí)，提取率減少。且超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的曲線更陡峭，說(shuō)明超聲時(shí)間影響更大，與表3結(jié)果相符。

圖1 超聲時(shí)間和液料比對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.1 Response surface plot and contour plot of ultrasonic time and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis(ANOVA)for regression equation of model

圖2和圖3中三維曲面與圖1相似，多糖提取率都是呈先增加后減小的趨勢(shì)，且等高線為圓形，說(shuō)明兩影響因素交互作用不顯著。

圖2 超聲時(shí)間和水浴溫度對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plot of ultrasonic time and water bath temperature on extraction of fucoidan

圖3 超聲時(shí)間和水浴時(shí)間對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.3 Response surface plot of ultrasonic time and water bath timeon extraction of fucoidan

圖4、圖5和圖6中三維曲面相似，多糖提取率依然呈先增加后減小的趨勢(shì)，由曲面可看出，變化幅度不大。等高線呈橢圓形，表明兩者有交互作用，但由表3可知，兩者交互作用并不顯著。

圖4 水浴溫度和液料比對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plot of water bath temperature and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

2.4 最佳工藝參數(shù)確定與模型驗(yàn)證

由中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)［17］優(yōu)化得試驗(yàn)結(jié)果為A=59.78 min，B=50.75 mL/g，C=90.79℃，D=4.98 h，Y為5.993%?？紤]實(shí)際操作，將提取條件修改為超聲時(shí)間為60 min，液料比為51 mL/g，水浴溫度為91℃，水浴時(shí)間為5 h。采用最佳提取條件，3次重復(fù)驗(yàn)證結(jié)果為5.966%，5.958%，5.960%，平均提取率為5.961%，與理論預(yù)測(cè)值相近。因此可以采用響應(yīng)面法來(lái)優(yōu)化巖藻多糖的提取工藝條件。

圖5 水浴時(shí)間和液料比對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of water bath time and liquid-solid ratio on extraction of fucoidan

圖6 水浴時(shí)間和水浴溫度對(duì)巖藻多糖提取率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of water bath time and water bath temperature on extraction of fucoidan

2.5 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)水浴法對(duì)比

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上對(duì)傳統(tǒng)水提巖藻多糖工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取條件和提取率如表4，通過(guò)對(duì)比，在超聲波輔助下，提取總時(shí)間縮短了2.4 h，多糖提取率提高了0.76%，這是因?yàn)槌暡ǖ淖饔锰岣吡速|(zhì)量傳遞效率，促使細(xì)胞中多糖更易釋放和擴(kuò)散到溶劑中［18］。而水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能導(dǎo)致多糖降解。

表4 超聲波輔助提取法與傳統(tǒng)水浴法對(duì)比Table 4 The comparison between Ultrasonic assisted extraction method and traditional water bath method

3 抗氧化活性結(jié)果與分析

3.1 羥自由基清除能力測(cè)定

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，Vc和巖藻多糖對(duì)·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷提高(圖7)。在0.05～0.4 mg/mL范圍內(nèi)，Vc對(duì)·OH的清除率顯著提高，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，清除率為97.93%。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度低于0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率較低，但增幅明顯。當(dāng)質(zhì)量濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內(nèi)，巖藻多糖對(duì)·OH的清除率從36.32%增加至77.47%，巖藻多糖和Vc半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.346 mg/mL和0.101mg/mL巖藻多糖對(duì)·OH的清除能力較好但低于Vc。

圖7 巖藻多糖和Vc對(duì)羥自由基的清除能力Fig.7 Hydroxyl free radical cavenging activity of fucoidan and Vc

3.2 巖藻多糖的O-2·清除能力測(cè)定

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，Vc和巖藻多糖對(duì)O2-·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷提高(圖8)。巖藻多糖質(zhì)量濃度低于0.2 mg/mL時(shí)，對(duì)O2-·的清除率較低，當(dāng)質(zhì)量濃度在0.2～1 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)O2-·的清除率增加較緩慢。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，Vc和巖藻多糖對(duì)O2-·的清除率分別為95.47%和52.87%。巖藻多糖和Vc半數(shù)抑制濃度IC50分別為0.893 mg/mL和0.268 mg/mL，巖藻多糖對(duì)O2-·清除作用低于水溶性Vc。

圖8 巖藻多糖和Vc對(duì)O2-·的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of fucoidan and Vc

3.3 DPPH法測(cè)定巖藻多糖的抗氧化能力

在試驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)質(zhì)量濃度低于0.6 mg/mL時(shí)，巖藻多糖對(duì)DPPH·的清除率高于水溶性Vc;巖藻多糖的半數(shù)抑制濃度IC50小于Vc，分別0.128 mg/mL和0.263 mg/mL;當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，清除率為68.36%，略低于水溶性Vc對(duì)DPPH·的清除率(圖9)。

圖9 巖藻多糖和Vc對(duì)DPPH·自由基的清除能力Fig.9 DPPH·scavenging activity of fucoidan and Vc

3.4 巖藻多糖的還原力測(cè)定

還原力的大小成為衡量其抗氧化活性的重要指標(biāo)之一，吸光度越大，還原力越大。Vc和巖藻多糖的還原力較好，隨著質(zhì)量濃度的增加，量效關(guān)系明顯，當(dāng)質(zhì)量濃度在1～4 mg/mL范圍內(nèi)，巖藻多糖的吸光度增加緩慢，還原力趨于平穩(wěn)。當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，還原力為Vc的62.69%(圖10)。

圖10 巖藻多糖和Vc還原能力Fig.10 Reduce activity of fucoidan and Vc

4 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面分析法系二次回歸方法，獲得鹿角菜中巖藻多糖的最佳提取條件為超聲時(shí)間60 min，液料比51(mL∶g)，水浴溫度91℃，水浴時(shí)間5 h。通過(guò)方差分析確定該二次回歸模型具有顯著性，一次項(xiàng)對(duì)提取率的影響顯著，四個(gè)參數(shù)的二次交互項(xiàng)雖存在交互作用，但均不顯著。在最佳提取條件下，巖藻多糖提取率達(dá)到5.961%，與理想預(yù)測(cè)值(5.993%)相比，相對(duì)誤差小于5%;通過(guò)與傳統(tǒng)水提法相比發(fā)現(xiàn)，提取總時(shí)間縮短了2.4 h，多糖提取率提高了0.79%。對(duì)最佳提取條件所得巖藻多糖脫蛋白透析后進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖具有良好的抗氧化能力，還原力隨著質(zhì)量濃度的增加而不斷提高，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度 IC50分別為 0.346 mg/mL、0.893 mg/mL和0.128 mg/mL;但與Vc相比，對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基清除作用較弱，但對(duì)DPPH的半數(shù)抑制濃度IC50小于Vc。因此為鹿角菜中巖藻多糖在保健食品，醫(yī)藥開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

［1］ 黃禮娟，蔡洪波，張華杰，等.鹿角菜采苗育苗技術(shù)的研究［J］.海洋水產(chǎn)研究，2008，29(1):70-76.

［2］ 曾呈奎，張峻甫.鹿角菜及其分布［J］.植物學(xué)報(bào)，1953，2(2):280-297.

［3］ Vilkhu K，Mawson R，Simons L，et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry-A review［J］.Innovative Food Science ＆ Emerging Technologies，2008，9(2):161-169.

［4］ XU Y，ZHANG L，Bailina Y，et al.Effects of ultrasound and/or heating on the extraction of pectin from grapefruit peel［J］.Journal of Food Engineering，2014，126(4):72-81.

［5］ CHEN S，CHEN H，TIAN J，et al.Enzymolysis-ultrasonic assisted extraction，chemical characteristics and bioactivities of polysaccharides from corn silk［J］.Carbohydrate Polymers，2014，101(1):332-341.

［6］ LI Q，YU N，WANG Y，et al.Extraction optimization of Bruguiera gymnorrhiza polysaccharides with radical scavenging activities［J］.Carbohydrate Polymers，2013，96(1):148-155.

［7］ SHEN S，CHEN D，LI X，et al.Optimization of extraction process and antioxidant activity of polysaccharides from leaves of Paris polyphylla［J］.Carbohydr Polym，2014，104(8):80-86.

［8］ YIN X，YOU Q，SU X.A comparison study on extraction of polysaccharides from Tricholoma matsutake by response surface methodology［J］.Carbohydr Polym，2014，102(4):419-422.

［9］ Box G E P，Wilson K B.On the experimental attainment of optimum conditions［J］.Journal of the Royal Statistical Society，1951，13(1):1-45.

［10］ XIA Y，KUANG H，YANG B，et al.Optimum extraction of acidic polysaccharides from the stems of Ephedra sinica Stapf by Box-Behnken statistical design and its anti-complement activity［J］.Carbohydrate Polymers，2011，84(1):282-291.

［11］ WANG Q，SUN Y，YANG B，et al.Optimization of polysaccharides extraction from seeds of Pharbitis nil and its anti-oxidant activity［J］.Carbohydr Polym，2014，102(3):460-466.

［12］ 李建，楊波，季宇彬.超聲波法提取裙帶菜多糖的工藝研究［J］.食品與藥品，2010，12(11):404-406.

［13］ 孫海森.海帶巖藻多糖硫酸酯的分離純化及相關(guān)活性研究［D］.杭州:浙江工商大學(xué)，2012.

［14］ 婁翠.廣東海帶巖藻多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性研究［D］.廣州:暨南大學(xué)，2012.

［15］ 郭欣.超聲處理對(duì)海洋巖藻聚糖硫酸酯分子鏈及結(jié)構(gòu)和抗氧化活性影響的研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2013.

［16］ Amarowicz R，Estrella I，Hernández T，et al.Free radical-scavenging capacity，antioxidant activity，and phenolic composition of green lentil(Lens culinaris)［J］.Food Chemistry，2010，121(3):705-711.

［17］ 黃禮徳，郭立強(qiáng)，劉勝利，等.正交設(shè)計(jì)優(yōu)化木賊多糖的超聲提取工藝(英文)［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2012，24(6):990-995.

［18］ ZHI Y，HAN X，LI J.Ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves［J］.Food Chemistry，2011，127(3):1273-1279.