李衛(wèi)娟，王計偉，王宇霄，劉春雪，洪平

(安佑生物科技集團(tuán)股份有限公司，江蘇 太倉，215437)

糞腸球菌是從動物腸道里分離出來的一種具有良好生物安全性及益生特性的腸道益生菌，可直接參與宿主的物質(zhì)代謝。其生長速度快，每19 min分裂1次，代謝過程中會分泌L-型乳酸、腸球菌素等非特異性免疫調(diào)節(jié)因子，并產(chǎn)生多種對動物生長有利的營養(yǎng)物質(zhì)［1-2］，因而常作為微生物飼料添加劑來增強(qiáng)動物腸道健康。然而其耐熱穩(wěn)定性較差，經(jīng)飼料高溫制粒及貯藏后，活菌數(shù)大大下降。一般來講，飼料中益生菌的數(shù)量應(yīng)在106/g以上才能使其順利到達(dá)腸道并發(fā)揮作用［3］，因此需要對提高糞腸球菌耐熱穩(wěn)定性的技術(shù)進(jìn)行研究。

目前國內(nèi)外在提高益生菌熱穩(wěn)定性方面已開展了大量的研究，主要包括菌種誘變、基因改造、微膠囊、保護(hù)劑等技術(shù)。關(guān)于保護(hù)劑方面的研究多集中于液態(tài)發(fā)酵的益生菌，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵的益生菌保護(hù)劑的研究則相對較少。采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的益生菌在穩(wěn)定性方面通常較液態(tài)發(fā)酵的益生菌要好，一方面固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)可作為營養(yǎng)基質(zhì)，另一方面可作為包埋基質(zhì)對菌體進(jìn)行包埋保護(hù)［4］。為了驗證保護(hù)劑的保護(hù)效果，最可靠的方法是常溫貯藏。但歷時較長，為了快速獲得結(jié)果，常采用加速儲存穩(wěn)定性試驗。加速儲存穩(wěn)定性試驗常用于預(yù)測凍干的動植物病毒及不同的微生物儲藏穩(wěn)定性，以便在短時間內(nèi)獲得儲藏數(shù)據(jù)［5-6］

本研究在固態(tài)發(fā)酵的基礎(chǔ)上優(yōu)化糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑配方，并通過加速儲存試驗，建立儲存穩(wěn)定性方程來預(yù)測其儲存壽命，為工業(yè)化生產(chǎn)中該產(chǎn)品有效活菌數(shù)的快速預(yù)測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糞腸球菌(Enterococcus faecalis):中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

海藻糖為食品級，美國RSG公司;抗壞血酸鈉、甘油為分析純;脫脂奶粉，伊利高蛋白脫脂高鈣奶粉。

種子培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母膏5.0，檸檬酸氫二銨2.0，葡萄糖20.0，乙酸鈉5.0，K2HPO42.0，MgSO40.58，MnSO40.25，蒸餾水1 L，加入吐溫80 1.0 mL，pH 6.26，121 ℃滅菌15 min。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/kg):麥麩940，豆粕40，玉米粉20，121℃滅菌30 min。

營養(yǎng)液(g/kg固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基):酵母膏2.5，蛋白胨 5.0，葡萄糖 10.0，牛肉膏 3.0，MgSO40.5，K2HPO40.5，500 mL自來水溶解，121℃滅菌15 min。

檢測培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10，牛肉膏5，葡萄糖20，NaCl 5，瓊脂粉15，pH 6.5，121 ℃滅菌 15 min。

1.2 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑的篩選

1.2.1 糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品制備

將活化后的種子液以10%的接種量與營養(yǎng)液一起接種至固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后于37℃培養(yǎng)12 h。

1.2.2 保護(hù)劑的優(yōu)化

根據(jù)前期試驗結(jié)果及文獻(xiàn)資料［7-12］，選用甘油、海藻糖、脫脂奶粉、抗壞血酸鈉作為保護(hù)劑的成分，采用正交試驗對保護(hù)劑的配比進(jìn)行優(yōu)化。試驗設(shè)計見表1。將各組成分以少許等量無菌水溶解后，分別與發(fā)酵完畢的糞腸球菌樣品混勻，40℃烘干收集。

表1 保護(hù)劑篩選正交試驗設(shè)計Table 1 The orthogonal experimental design for protectants screen

1.2.3 耐熱型復(fù)合保護(hù)劑保護(hù)效果評價

采用人工耐熱性試驗對上述各試驗組保護(hù)劑的保護(hù)效果進(jìn)行評價。測定方法:將含有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶置于60℃水浴鍋中預(yù)熱20～30 min，使瓶內(nèi)溫度與水浴鍋溫度一致，分別稱取25 g樣品加至相應(yīng)的三角瓶中，處理5 min后迅速冰浴冷卻，20℃ 200 r/min 0.5 h后通過梯度稀釋法測定活菌數(shù)。以未經(jīng)水浴處理的作為對照組。

1.3 糞腸球菌加速儲存穩(wěn)定性試驗

將加入最佳保護(hù)劑配方的糞腸球菌樣品置于不同溫度下儲存，按照試驗設(shè)計(見表2)中的時間取樣測定活菌數(shù)。

表2 加速儲存穩(wěn)定性試驗分組Table 2 The experimental design for the accelerated storage test

以40、50、60℃下樣品的殘余菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，放置時間為橫坐標(biāo)作圖，得到該糞腸球菌樣品的模擬一級熱降解圖，由此得到對應(yīng)溫度下樣品的熱降解速率K。以熱降解速度K的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，溫度(絕對溫度)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得到一元線性回歸方程，繼而推算出某一溫度下的熱降解速率常數(shù)，結(jié)合一級反應(yīng)動力學(xué)方程推導(dǎo)出該溫度下貯存一段時間后的殘余菌數(shù)。為驗證方程的有效性，將添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品于25℃貯藏，分別于15、30、45天取樣測定活菌數(shù)以驗證方程的有效性。

2 結(jié)果與討論

2.1 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑的篩選

本研究選用脫脂奶粉、海藻糖、甘油、抗壞血酸鈉4種保護(hù)劑，根據(jù)參考文獻(xiàn)常見添加水平設(shè)計正交試驗，結(jié)果見表3。從表3可以看出，各因素對糞腸球菌穩(wěn)定性的影響水平大小為:脫脂奶粉＞抗壞血酸鈉＞海藻糖＞甘油，最佳組合為A1B2C2D2，即抗壞血酸鈉 10 g/kg、海藻糖 30 g/kg、甘油 40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。經(jīng)驗證，60℃水浴處理5 min后平均存活率為75%(3個平行存活率分別為71%，76.74%，78%)，與未添加保護(hù)劑的對照組(3個平行存活率分別為51.92%，49%，46.29%)相比差異極顯著(P=0.000 6＜0.01)。

表3 糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑篩選正交試驗結(jié)果Table 3 Results of the orthogonal experiment for protectants screen of E.faecalis

目前可作為微生物保護(hù)劑的物質(zhì)通常包括脫脂奶粉、明膠、蔗糖、海藻糖、甘油、谷氨酸鈉等。研究表明，脫脂奶粉中的乳清蛋白尤其是酪蛋白在干燥時，可以在菌體表面形成一層蛋白膜，對細(xì)胞加以保護(hù)。而抗壞血酸鈉則作為水溶性強(qiáng)抗氧化劑，減少菌體在干燥或貯存過程中環(huán)境中氧氣對菌體的影響［13］。甘油作為一種可滲透至細(xì)胞內(nèi)部的保護(hù)劑，通過進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓平衡，從而減輕細(xì)胞由于溫度升高引起的細(xì)胞損傷。在多種保護(hù)劑的共同作用下，菌體在干燥及保存過程中受外界不良環(huán)境的影響降低。孫盈等人對混合乳酸菌的最佳耐熱凍干保護(hù)劑進(jìn)行了研究，確定其最佳凍干保護(hù)劑配方為脫脂奶粉10%、聚乙烯吡咯烷酮5%、海藻糖5%、VC0.5%，凍干存活率預(yù)測值可達(dá)93.05%［9］。

2.2 糞腸球菌加速儲存穩(wěn)定性試驗

低溫留樣觀察是測定產(chǎn)品儲存穩(wěn)定性的一種重要方法，但儲存時間往往較長，可通過加速儲存穩(wěn)定性試驗來對產(chǎn)品的穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究。按照1.3中的試驗方法進(jìn)行試驗，以儲存一段時間后的菌數(shù)N的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，儲存時間為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度 K分別為-0.002，-0.009，-0.061。

圖1 糞腸球菌殘余菌數(shù)與貯藏溫度和時間的關(guān)系圖Fig.1 Graphic correlation between survival of E.faecalis and the time at different temperature

以添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品在40，50，60℃的熱降解速度K的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，溫度(絕對溫度)的倒數(shù)為橫坐標(biāo)作圖(見圖2)，得到一元線性回歸方程:lgK=-7 730/T+21.95，通過該方程可計算出25℃下糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品的熱降解速率常數(shù)為-1.06×10-4，4℃熱降解速率常數(shù)為-1.15×10-6。張英華等［12］對加入冷凍干燥保護(hù)劑的乳酸菌進(jìn)行了加速儲存穩(wěn)定性研究，通過方程推導(dǎo)出4℃的熱降解速率為-1.656×10-4，本研究中糞腸球菌4℃的熱降解速率約為其1/100，具有更好的熱穩(wěn)定性。

圖2 糞腸球菌熱降解速率與溫度的關(guān)系圖Fig.2 The correlation between the thermal degradation rate and temperature of Enterococcus faecalis

為驗證方程的有效性，將添加保護(hù)劑的糞腸球菌固態(tài)發(fā)酵樣品于25℃分別貯存15，30，45 d并測定殘余活菌數(shù)，與預(yù)測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表4。從表4可以看出，貯存15，30天的實際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果極為接近，精確率接近100%，貯存45天的實際結(jié)果與預(yù)測結(jié)果相比，精確率達(dá)到為90.6%，因此可用該方程來預(yù)測某一溫度下儲藏一定時間之后樣品的殘余菌數(shù)。

表4 25℃下儲存穩(wěn)定性方程有效性驗證結(jié)果Table 4 The results of validity verification for the storage stability equation at 25℃

3 結(jié)論

通過正交試驗優(yōu)化結(jié)果，確定糞腸球菌耐熱型保護(hù)劑配方為:抗壞血酸鈉10 g/kg、海藻糖30 g/kg、甘油40 g/kg、脫脂奶粉80 g/kg。加入該保護(hù)劑的糞腸球菌樣品經(jīng)60℃處理5 min后平均存活率為75%，與未添加保護(hù)劑的對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。分別于40，50，60℃對添加保護(hù)劑的糞腸球菌樣品進(jìn)行加速儲存試驗，并建立了儲存穩(wěn)定性方程:lgK=-7 730/T+21.95，根據(jù)該方程可知糞腸球菌25℃熱降解速率為-1.06×10-4。將樣品于25℃分別貯存15，30，45 d，測定殘余活菌數(shù)，并與預(yù)測理論值比較，接近程度在90%以上，驗證了方程的有效性。

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