王鑫，徐麗萍，宋志鵬

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150076)

雞軟骨中的硫酸軟骨素(簡稱CS)作為結(jié)締組織天然存在的重要成分，發(fā)揮著許多生理功能。比如CS可以和膠原蛋白結(jié)合成高分子材料而起到使各器官特定結(jié)構(gòu)固定的作用［1］。雖然CS的主鏈結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜，但就硫酸基、硫酸化程度和2種差異向異構(gòu)糖醛酸鏈內(nèi)的分布呈現(xiàn)了高度的不均一性。CS的精細(xì)結(jié)構(gòu)決定著其與多種蛋白質(zhì)分子的相互作用以及功能的特異性［2］。因此，作為動物軟骨中特有的糖胺聚糖，CS還具有調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)機能、防治動脈硬化、抗凝血、清除自由基、增強免疫、抗病毒、調(diào)節(jié)動物體內(nèi)水分和抗腫瘤等多種生理功能［3］。從雞軟骨中提取的CS中，除含有酸性黏多糖外，還含有很多水溶性物質(zhì)，而這些物質(zhì)的存在則會降低提取物中CS的含量，降低CS的生理活性，因此實驗過程中必須將這些雜質(zhì)除去，以提高CS的純度［4］。

離子交換樹脂是一種具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)且含有離子活性基團(tuán)而且能與溶液中的其他物質(zhì)進(jìn)行交換或吸附的聚合物，利用它與流動相中的離子可以進(jìn)行可逆的交換這一性質(zhì)來對離子型化合物進(jìn)行純化。由于化合物所帶電荷性質(zhì)和數(shù)量的不同，進(jìn)而與樹脂的交換或吸附能力也不同，利用該性質(zhì)可對雞軟骨中的CS進(jìn)行分離純化［5-6］。凝膠層析法又稱排阻層析、分子篩過濾等。它的優(yōu)點是層析所用的凝膠是1種具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且呈珠狀顆粒的惰性載體，每個顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子一樣，直徑大于孔徑的分子將無法進(jìn)入凝膠內(nèi)部，便直接沿凝膠顆粒的間隙流出，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣泛的溫度范圍下進(jìn)行，無需有機溶劑，設(shè)備簡單，操作方便，并且保持所分離成分的生物學(xué)活性，對于高分子物質(zhì)有很好的純化效果［7］。采用離子交換樹脂法對CS粗提物進(jìn)行純化工藝的研究，為獲得純度較高的CS，將進(jìn)一步采用凝膠層析對其進(jìn)行純化，以期得到更好的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

硫酸軟骨素粗提物，實驗室自制;硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma公司;732陽離子交換樹脂，杭州爭光化工廠;D218陰離子交換樹脂，西安藍(lán)曉科技新材料有限公司;201*7型樹脂，沈陽市新西試劑廠;葡聚糖凝膠G-75，上海君威生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中硫酸軟骨素

稱取5份3 g原料，分別置于燒杯中，按料液比1∶6(g:mL)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液，將燒杯置于超聲波儀器中，在100 W的功率下超聲處理100 min，調(diào)節(jié)pH值為6.8。按13∶10 000(g:mL)的酶質(zhì)量和溶液體積比加入木瓜蛋白酶(酶活力80萬U/g)，在45℃恒溫水浴中加熱1h，然后將燒杯迅速放入90℃水浴箱中并保溫20 min進(jìn)行滅酶，用HCl調(diào)節(jié)pH值至5.9。按13∶10 000(g:mL)的酶質(zhì)量和溶液體積比加入胃蛋白酶(酶活力3 000 U/g)，分別在48℃恒溫水浴加熱103 min。迅速升溫到90℃保溫20 min滅酶。調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.2內(nèi)，按溶液總體積的3%加入NaCl，攪拌均勻后加入無水乙醇，使乙醇濃度達(dá)到70%，靜置12h，吸出上清液后收集沉淀進(jìn)行離心，在用乙醇對沉淀進(jìn)行1～2次的洗滌，置于55～60℃干燥箱中干燥、粉碎后即得成品，稱量，計算 CS 的得率［8］。

1.2.2 離子交換樹脂純化硫酸軟骨素

1.2.2.1 D218離子交換樹脂的預(yù)處理

用去離子水浸泡離子交換樹脂數(shù)小時后進(jìn)行過濾，然后用體積分?jǐn)?shù)85%乙醇浸泡3h后用去離子水洗凈。采用2倍樹脂體積、濃度為70mg/mL的HCl溶液浸泡3h，再用去離子水洗至中性，然后濾干。再采用2倍樹脂體積、濃度為80mg/mL的NaOH溶液浸泡3h，用大量去離子水洗至中性，最后用去離子水浸泡備用。

1.2.2.2 D218離子交換樹脂純化硫酸軟骨素工藝條件的選擇

將D218陰離子交換樹脂采用濕法裝柱后，分別用 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的樹脂與 CS 粗提物水溶液體積比進(jìn)行動態(tài)吸附實驗，分別吸附30、40、50、60、70 min 后，將 CS 粗提物水溶液以 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min的流速分別經(jīng)過玻璃樹脂柱，采用樹脂與NaCl溶液體積比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的比例，分別用濃度為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mol/L 的NaCl溶液對已經(jīng)飽和的樹脂進(jìn)行洗脫，每隔15 min收集一次洗脫液，共收集8次，分別測定每一次的CS含量，確定最佳解吸時間。測定流出液中CS的含量，并計算其吸附率，選出樹脂純化最佳條件［9］。

1.2.3 凝膠層析法純化硫酸軟骨素

1.2.3.1 葡聚糖凝膠G-75的預(yù)處理

取18g葡聚糖凝膠G-75粉末，浸泡于300 mL蒸餾水中使其充分溶脹(室溫，24 h)，然后經(jīng)過反復(fù)傾斜除去表面的懸浮顆粒，將葡聚糖凝膠G-75浸泡過夜備用。

1.2.3.2 凝葡聚糖凝膠G-75純化硫酸軟骨素步驟

將凝膠裝柱、上樣和平衡后，采用pH值為4.8的乙酸-乙酸鈉溶液進(jìn)行洗脫，將CS粗純物水溶液以0.7 mL/min的流速經(jīng)過凝膠，采用自動部分收集器對流出液進(jìn)行收集，共接50支管，每管接約2.5 mL。

1.2.3.3 硫酸軟骨素純化物制備

通過離子交換樹脂和凝膠層析法最佳工藝條件純化CS，經(jīng)干燥濃縮后即得CS純化物，并計算CS的純度:

式中:W，CS純度，%;m，純化物中CS的質(zhì)量，g;m1，純化物的質(zhì)量，g。

1.2.4 硫酸軟骨素HPLC分析

色譜柱:Ultimate XB-NH2柱(25 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:30℃;檢測波長:232 nm;流動相:醋酸鈉緩沖溶液(pH 5.6)-乙腈(體積比95∶5);進(jìn)樣量10 μL;流速:1.0 mL/min。比較CS標(biāo)準(zhǔn)品與樣品圖譜出峰位置和保留時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中CS

以CS得率為指標(biāo)，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取雞軟骨中CS，結(jié)果見表1。

表1 超聲波輔助堿-雙酶法提取CSTable 1 Ultrasonic-assisted extraction CS with alkali-double enzymatic

由表1可知，采用超聲波輔助堿-雙酶法提取CS得率最高，為26.85%。采用雙酶法進(jìn)行2次酶解可以充分水解CS中的蛋白質(zhì)，而且水解過程中既不會使CS發(fā)生水解也不會產(chǎn)生水解黏多糖的酶。同時，還可從提取CS的廢液中回收蛋白，既解決了環(huán)境污染問題，還可以確?；厥盏牡鞍踪|(zhì)的品質(zhì)和風(fēng)味。

2.2 離子交換樹脂法純化硫酸軟骨素實驗結(jié)果分析

2.2.1 硫酸軟骨素純化最佳上樣量的確定

圖1 上樣量的選擇Fig.1 The optimum choice of the sample volume

由圖1所示，隨著CS粗提液用量和樹脂體積比的不斷加大，CS的吸附率呈整體下降趨勢。在二者體積比為1∶1時，吸附率為最大值，此時樹脂可能已經(jīng)處于飽和狀態(tài)，如果繼續(xù)增大上樣量，就會造成部分CS成分的損失。而如果上樣量過少，就會使純化時間變長，因此針對吸附效果以及經(jīng)濟(jì)因素方面的考慮，確定CS粗提液用量與樹脂體積比為1∶1為最佳上樣量。

2.2.2 硫酸軟骨素純化最佳吸附時間的確定

如圖2所示，吸附時間在30～70 min時曲線呈上升趨勢，吸附率在60 min吸附時間處取得最大值，當(dāng)吸附時間超過60 min后吸附率反開始下降。這可能是由于吸附是以物理過程為主伴隨這化學(xué)吸附，如果時間過長，就會破壞樹脂達(dá)到的平衡，故確定60 min為最佳吸附時間。

圖2 最佳吸附時間的選擇Fig.2 The optimum choice of the adsorption time

2.2.3 硫酸軟骨素純化流速的確定

如圖3所示，CS吸附率取得最大值是在吸附流速為0.5 mL/min時，而當(dāng)吸附流速超過1.0 mL/min時，吸附率呈逐漸下降的趨勢。其原因是較快的流速不利于吸附的進(jìn)行，但流速過慢又會使純化時間延長，增加生產(chǎn)成本。而CS的吸附率在0.5和1.0 mL/min的流速中差異不大，所以從經(jīng)濟(jì)成本的角度考慮吸附流速應(yīng)以1.0mL/min為宜。

圖3 流速的選擇Fig.3 The optimum choice of the flow rate

2.2.4 硫酸軟骨素純化洗脫劑NaCl濃度的確定

如圖4所示，當(dāng)NaCl溶液濃度為1.5～3.5 mol/L時，洗脫液中CS含量呈上升趨勢，當(dāng)NaCl溶液濃度3.0 mol/L時CS的解吸率最大，當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增大時呈下降趨勢，這是由于隨著NaCI濃度的不斷增大，其它某些雜質(zhì)也會隨CS一起沉淀出來，從而使CS的純度降低。因此確定CS純化最佳洗脫濃度為3.0 mol/L。

圖4 洗脫液濃度的選擇Fig.4 The optimum choice of the concentration of the eluant

2.2.5 硫酸軟骨素純化洗脫劑NaCl用量的確定

如圖5所示，當(dāng)洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂體積比在1∶1～5∶1時，解吸率呈逐漸上升的趨勢。當(dāng)洗脫劑NaCl溶液的用量與樹脂體積比為5∶1時，CS的解析率達(dá)到最大值;但是繼續(xù)加大洗脫液用量時解吸率反而降低，可能是因為隨洗脫液體積增大溶液中的CS的質(zhì)量濃度減小，從而影響了CS溶液的洗脫效果，因此應(yīng)確定5∶1為CS純化洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂用量的最佳體積比。

圖5 NaCl用量的選擇Fig.5 The optimum choice of the NaCl amount

2.2.6 硫酸軟骨素純化解吸時間的確定

如圖6所示，CS的解吸率隨解吸時間的延長而增大。在解析時間為75 min時，CS的解吸達(dá)到最大值，繼續(xù)增加解吸時間，曲線則呈下降趨勢且趨于穩(wěn)定，這說明時樹脂中的CS在解吸75 min時已基本解吸完全，故確定75 min為最佳解吸時間。

圖6 最佳解吸時間的選擇Fig.6 The optimum choice of the desorption time

2.3 葡聚糖凝膠G-75洗脫硫酸軟骨素結(jié)果與分析

從圖7中可以看出，采用流速為0.7 mL/min的的乙酸-乙酸鈉溶液(pH=4.8)洗脫時，隨著管數(shù)的推進(jìn)，吸光值逐漸增加，在第30管出現(xiàn)最大吸光值為0.785，之后隨著管數(shù)的推進(jìn)，吸光值逐漸減小，在第42管出現(xiàn)零值，之后全部為零趨于穩(wěn)定。由此可見，第30管CS含量最高，第42管之后幾乎不含有CS。

圖7 CS洗脫結(jié)果Fig.7 The elution result of CS

2.4 離子交換樹脂法制備硫酸軟骨素純化物

采用離子交換樹脂D218純化CS的最佳工藝條件為:CS粗提物溶液體積與樹脂體積比為1∶1，吸附流速為1.0 mL/min，吸附時間為60 min，洗脫劑為3.0 mol/L的NaCl溶液，最佳解析時間為75 min，洗脫劑用量與樹脂體積比為5∶1，再采用葡聚糖凝膠G75純化CS，純化后CS純化物的純度見表2。

表2 CS純化物的純度表Table 2 The purity result of purified product of CS

如表2所示，離子交換樹脂法純化后的CS純度為72.03%，葡聚糖凝膠G-75純化后CS純化物的純度提高至99.30%。

2.5 HPLC檢測結(jié)果與分析

由圖8、圖9可以看出，CS標(biāo)準(zhǔn)品和純化后的CS樣品有相同的出峰位置，峰形較好，保留時間比較短，且均在17.5～18.5 min內(nèi)，進(jìn)一步證明了提取于雞軟骨中并經(jīng)過純化后得到的物質(zhì)為CS。

圖8 CS標(biāo)準(zhǔn)品HPLC檢測圖譜Fig.8 HPLC chromatograms of CS standard

圖9 CS純品HPLC檢測圖譜Fig.9 HPLC chromatograms of CS sample

3 結(jié)論

采用離子交換樹脂法及凝膠層析法對超聲波輔助堿-雙酶法提取的CS進(jìn)行純化并對純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并對純化后得到的物質(zhì)進(jìn)行了定性定量分析。通過靜態(tài)吸附及解吸實驗的篩選，確定CS的最佳純化樹脂為D218型陰離子交換樹脂。離子交換樹脂法純化CS的最佳工藝條件為:吸附液用量與樹脂體積比為1∶1吸附流速為1.0 mL/min;吸附時間為60 min;洗脫劑NaCl溶液的濃度為3.0 mol/L;洗脫劑NaCl溶液用量與樹脂體積比為5∶1;最佳解析時間為75 min。純化后CS純度為72.03%。采用凝膠層析法純化CS，純化后CS純度為99.30%。通過高效液相色譜法對純化后的物質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明純化后得到的物質(zhì)與CS標(biāo)準(zhǔn)品出峰位置以及結(jié)構(gòu)都一致，進(jìn)一步證明從雞軟骨中提取的物質(zhì)為CS。

［1］ 陳亞.硫酸軟骨素生產(chǎn)工藝的優(yōu)化研究［D］.上海:華東理工大學(xué)，2010:1-65.

［2］ Volpi N.Quality of different chondroitin sulfate preparations in relation to their therapeutic activity ［J］.J Pharm Pharmacol，2009，61:1 271-1 280.

［3］ Takanishi G C，Borst C A.Glucosamine and chondroitin in the treatment of osteoarthritis［J］.Women's Health Primary Care，2001，4(1):61.

［4］ 呂惠中.硫酸軟骨素的分離純化及其抗凝血作用的研究［D］.山東:青島大學(xué)，2003，1-57.

［5］ 謝果凰.鯊魚硫酸軟骨素的分離提純及其抗氧化功能的研究［D］.江蘇:寧波大學(xué)，2010:1-54.

［6］ 蘇現(xiàn)波，劉安軍.羊軟骨粘多糖的提取與分離［J］.食品工業(yè)科技，2004，25(3):98-100.

［7］ 羅秉俊，張?zhí)K云.凝膠層析分離提純蘆薈多糖的方法［J］.蘆薈產(chǎn)業(yè)，2011，(2):78.

［8］ 陳紅麗，楊永鋒，于建軍.胃蛋白酶提取硫酸軟骨素的研究［J］.應(yīng)用化工，2009，38(12):1 766-1 768.

［9］ 李鑫，姚開，賈冬英，等.硫酸軟骨素的提取和純化分離技術(shù)［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2004，16(6):597-60.