邸 倩，邱明才，張 鑫，楊 靜(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科，太原 03000;天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院內(nèi)分泌科)

吡格列酮為噻唑烷二酮類藥物(TZDs)，噻唑烷二酮類藥物是治療糖尿病的一類新藥，主要通過(guò)激活PPAR-γ(過(guò)氧化物酶酶體增殖受體)，增加多種基因編碼蛋白的表達(dá)［1］，從而提高胰島素敏感性。近來(lái)有研究表明，TZDs可能導(dǎo)致骨量減少，可能增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)［2］，但也有報(bào)道，TZDs不影響骨轉(zhuǎn)換及骨密度［3］。本文探討不同劑量PIO干預(yù)影響糖尿病大鼠骨代謝指標(biāo)及骨密度。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用鼠齡相同、平均體重約240 g的雄性SD大鼠38只［二級(jí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào):SGCK(京)2008－0001］，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，自然晝夜光線照明，室內(nèi)相對(duì)濕度40%－70%，室溫保持于20－25℃。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食。

1．1．2 主要藥物和試劑 鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)、微量血糖試紙(羅氏診斷有限公司)、PIO(北京太洋有限公司)

1．1．3 實(shí)驗(yàn)所用檢測(cè)試劑盒 血清鈣磷、尿鈣檢測(cè)試劑盒(鄰甲酚肽絡(luò)合酮檢測(cè)試劑盒，通用型):中生北控生物科技股份有限公司;血堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(通用型):中生北控生物科技股份有限公司。

1．1．4 主要儀器 ACCT-CHECK Active血糖儀(羅氏診斷有限公司)、TN-100B型托盤扭力天平(上海第二天平儀器廠)、半自動(dòng)生化分析儀(荷蘭Vital Scientific公司)、PRODYIGY型雙能X線骨密度儀。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 實(shí)驗(yàn)分組 選取平均體重約為240 g的雄性SD大鼠38只，隨機(jī)選擇10只為正常對(duì)照組，其余28只大鼠為造模成功的大鼠，按血糖和體重分層，隨機(jī)分為PIO小劑量治療組(4 mg/(kg·d)，n=10)、PIO 大劑量治療組(20 mg/(kg·d)，n=8)、DM未治療組(n=10)。造模前夜，大鼠自由進(jìn)食水。造模當(dāng)日實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重，將大鼠置于鼠盒，酒精棉球擦拭大鼠尾部使尾靜脈暴露，按照45 mg/kg尾靜脈一次注射STZ(以0．1 mol/L pH 4．2的無(wú)菌枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液配制成濃度為2%的溶液)，1 ml注射器穿刺尾靜脈，見(jiàn)回血后30 s內(nèi)勻速完成推注。給藥后72 h和1周后測(cè)定大鼠尾靜脈血糖，血糖兩次均大于16．7 mmol/L判定為DM造模成功。正常對(duì)照組大鼠僅尾靜脈注射等體積的枸櫞酸－枸櫞酸鈉緩沖液。全部動(dòng)物于成模后干預(yù)16周處死。干預(yù)期間未應(yīng)用吡格列酮之外的降糖藥物，每日上午9∶00時(shí)給藥，吡格列酮混懸液灌胃服用。干預(yù)期間無(wú)因血糖原因死亡大鼠。

1．2．2 大鼠一般狀況檢測(cè) 每周檢測(cè)大鼠體重;成模后每月經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，應(yīng)用血糖儀檢測(cè)大鼠血糖;處死前留取24 h尿，記錄尿量，以備測(cè)定24 h尿鈣，24 h尿磷。

1．2．3 血清鈣、磷，24 h尿鈣檢測(cè) 采用鄰甲酚肽絡(luò)合銅比色法檢測(cè)血尿鈣水平。

1．2．4 血清骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物檢測(cè) 血清堿性磷酸酶(alkaline phosphotase，ALP)的測(cè)定:處死前經(jīng)股動(dòng)脈取血，分離血清，－20℃保存。在VITALAB-micro半自動(dòng)生化分析儀上采用連續(xù)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)血清ALP的酶活度。

1．2．5 骨密度測(cè)定 測(cè)量時(shí)將股骨和椎骨(L1－5)放在一個(gè)小動(dòng)物平臺(tái)上，沿平臺(tái)的長(zhǎng)軸放置。BMD測(cè)定用美國(guó)Lunar公司的Prodigy型DEXA骨密度儀，配備小動(dòng)物測(cè)量軟件，儀器測(cè)定質(zhì)控體模的變異系數(shù)為0．09%。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 各組大鼠血清鈣磷比較

處死前股動(dòng)脈放血收集血標(biāo)本，離心后收集血清，用鄰甲酚酞絡(luò)合銅比色法測(cè)定各組大鼠處死前血鈣水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠之間血清鈣水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。同時(shí)測(cè)定大鼠處死前血清磷水平，各組大鼠之間血清磷水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05，見(jiàn)表1)。

2．2 各組大鼠24尿量和24 h尿鈣比較

處死前留取各組大鼠24 h尿，記錄尿量，用鄰甲酚肽絡(luò)合銅比色法測(cè)定各組大鼠24 h尿鈣水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各DM組大鼠24 h尿量顯著高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。24 h尿鈣水平比較顯示，不同劑量組和未治療組大鼠24 h尿鈣顯著高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，且三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見(jiàn)表1)。

2．3 各組大鼠血清堿性磷酸酶(ALP)水平的比較

處死前股動(dòng)脈放血收集血標(biāo)本，用半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定ALP酶活度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組大鼠血清堿性磷酸酶水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05，見(jiàn)表1)。

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿鈣比較(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

表1 各組大鼠血清Ca、P、ALP、24 h尿量、尿鈣比較(±s)Table 1 Comparison of serum Ca，P and ALP，and 24 h urine volume and urine Ca，among four groups(±s)

與對(duì)照組相比，★P ＜0．01

組別 n Ca(mmol/L) P(mmol/L) 24 h尿量(ml) 24 h尿鈣(mg) ALP(U/L)低劑量組 10 2．52 ±0．06 1．64 ±0．10 98．70 ±5．75★ 16．09 ±5．62★166．3 ±6．24高劑量組 10 2．51 ±0．09 1．64 ±0．07 97．40±4．82★ 16．32 ±2．32★ 163．5±7．34未治療組 8 2．52 ±0．11 1．65 ±0．06 99．51±11．96★ 17．03 ±3．92★ 164．1±5．62對(duì)照組 10 2．54 ±0．08 1．63 ±0．06 30．80 ±3．37 2．98 ±0．58163．7 ±6．68

2．4 各組大鼠骨密度(BMD)的比較

用DEXA雙能X線骨密度儀測(cè)定各組大鼠骨密度，結(jié)果提示，DM各組與對(duì)照組比較，股骨和腰椎骨密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0．01)。高劑量組股骨和腰椎骨密度低于其他三組(P＜0．05，見(jiàn)表2)。

與對(duì)照組相比，低劑量組大鼠股骨骨密度減低2．25%，高劑量組減低3．93%，未治療組減低1．69%。與未治療組相比，高劑量組減低2．29%;與低劑量組相比，高劑量組減低1．72%。

與對(duì)照組相比，低劑量組大鼠腰椎骨密度減低3．03%，高劑量組減低4．04%，未治療組減低2．53%。與未治療組相比，高劑量組減低1．55%，余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與低劑量組相比，高劑量組減低1．04%。

表2 各組大鼠骨密度比較(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

表2 各組大鼠骨密度比較(±s)Table 2 Comparison of the body mineral density among four groups(±s)

與對(duì)照組相比，★P ＜0．01;與未治療組相比，△P ＜0．05;與低劑量組相比，#P ＜0．05

組別 n 股骨骨密度(g/cm2) 腰椎骨密度(g/cm2)低劑量組 10 0．174±0．013★ 0．192±0．009★10 0．178 ±0．012 0．198 ±0．011高劑量組 10 0．171 ±0．009★△# 0．190 ±0．004★△#未治療組 8 0．175±0．008★ 0．193±0．011★對(duì)照組

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，各PIO干預(yù)組對(duì)DM大鼠的血鈣、磷水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。最近一項(xiàng)臨床研究顯示，PIO干預(yù)對(duì)糖尿病患者的血鈣、磷指標(biāo)無(wú)顯著影響，與本研究結(jié)果一致［4］。各 PIO干預(yù)組對(duì)DM大鼠的24 h尿鈣水平均無(wú)顯著影響?？紤]與以下因素有關(guān):①本實(shí)驗(yàn)DM大鼠模型近似于1型DM，PIO干預(yù)對(duì)血糖及胰島素敏感性均無(wú)顯著影響，因此，對(duì)DM大鼠尿糖增高的滲透性利尿及胰島素絕對(duì)缺乏造成的鈣鹽丟失無(wú)顯著影響。②可能PIO有與羅格列酮相似的作用抑制IGF－Ⅰ造成鈣鹽丟失。Sugimoto等［5］在體外實(shí)驗(yàn)以羅格列酮(1 μmol/L)作用于骨髓細(xì)胞(UAMS－33)，減少了胰島素樣生長(zhǎng)因子－Ⅰ(IGF－Ⅰ)、IGF－Ⅱ、IGF結(jié)合蛋白(IGF－BP4)及IGF－Ⅰ受體、IGF－Ⅱ受體的表達(dá);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)以羅格列酮［(20 mg/(kg·d)］作用于B6鼠抑制了骨及肝臟IGF－Ⅰ水平。③PIO干預(yù)對(duì)DM大鼠腎臟有保護(hù)作用，因此，減弱了1α羥化酶受損造成的尿鈣重吸收減少。PIO干預(yù)對(duì)DM大鼠的24 h尿鈣水平影響是多種因素綜合影響的結(jié)果。

吡格列酮干預(yù)組無(wú)論低劑量或高劑量組分別與DM組相比，血清堿性磷酸酶水平均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這可能是因?yàn)橥ǔ２捎玫臏y(cè)定方法反映的是總堿性磷酸酶的水平。血清堿性磷酸酶來(lái)源廣泛，骨、肝、腸、腎等部位均可分泌，因而缺乏組織特異性。

結(jié)果提示，高劑量PIO組干預(yù)導(dǎo)致大鼠股骨及腰椎(L1－L4)骨密度均減少，而低劑量PIO組干預(yù)對(duì)大鼠骨密度未造成影響。既往有關(guān)TZDs對(duì)DM骨轉(zhuǎn)換及骨密度影響的研究較少且頗具爭(zhēng)議。Lecka-Czernik等［6］以羅格列酮［20 mg/(kg·d)］干預(yù)C57BL/6J(B6)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做出與本實(shí)驗(yàn)相一致的結(jié)果。也有認(rèn)為，TZDs改善血糖而減低了DM骨轉(zhuǎn)換，機(jī)體BMD增加，而這種骨轉(zhuǎn)換的減低發(fā)生在血糖改善之前，提示TZDs可能對(duì)骨有直接作用［7］。最近丹麥Syversen等給予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮［35 mg/(kg·d)］，治療4個(gè)月發(fā)現(xiàn)大鼠股骨及腰椎骨密度均減低，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［8］。一項(xiàng)研究顯示，小劑量吡格列酮［3 mg/(kg·d)］干預(yù)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠，不影響骨密度，骨吸收及骨代謝，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［9］。Lecka-Czernik等［10］的骨髓干細(xì)胞培養(yǎng)與羅格列酮［20 mg/(kg·d)］干預(yù)C57BL/6J(B6)鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，大鼠骨小梁體積減少，通過(guò)骨形成速率減低造成骨量減少。也有研究顯示不同的結(jié)果。Syversen等［8］給予未去除卵巢的完整雌鼠(Fischer－344)吡格列酮35 mg/(kg·d)治療4個(gè)月發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁體積減少，該實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞培養(yǎng)也未能顯示任何與羅格列酮類似的影響前成骨細(xì)胞分化的作用，而僅表現(xiàn)為血清OPG減低，推測(cè)PPARγ激動(dòng)劑可能主要對(duì)骨吸收起作用。有研究表明，這種結(jié)果差異可能與TZDs激活PPARγ的活性不同有關(guān)［11］。較為公認(rèn)的是，TZDs減低骨密度及形成“脂肪骨”，至少部分是因?yàn)殚g充質(zhì)細(xì)胞從骨生成方向脫離向脂肪生成分化［12］。

綜上所述，TZDs可能減低骨密度，宜小劑量使用，使用選擇性PPARγ調(diào)節(jié)劑(SPPARγMs)或許是將來(lái)的一個(gè)新的研究方向［13］。當(dāng)然，還需大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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