張 沛，楊國(guó)輝，魏麗娟，李卓偉，王德功，劉 冬

（河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司，河北石家莊 050041）

稻殼是一種產(chǎn)量大、價(jià)格廉的可再生資源，據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)稻殼年產(chǎn)量在4000萬t左右 （余君，2008）。然而稻殼除被田間焚燒或堆積外只有很少一部分被合理利用。目前部分企業(yè)將稻殼粉碎烘干，作為干飼料直接出售，然而未經(jīng)處理的稻殼干飼料蛋白含量低，纖維含量多，不能得到合理使用，造成資源的浪費(fèi)。

稻殼中主要含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、灰分等，其中纖維素類物質(zhì)約占63.67%（邢廷銑，2000），木質(zhì)素和半纖維素將結(jié)晶化纖維素包裹住，阻止了微生物的利用（劉雅琴等，2010），而且這些粗纖維、木質(zhì)素被畜禽食后也很難吸收。目前處理纖維類含量高的物質(zhì)主要采用的方法有物理法、化學(xué)法和生物法。然而單純的一種方法處理，很難從根本上解決其難吸收、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值低等問題。本試驗(yàn)預(yù)先用一定濃度的堿液處理稻殼粉，破壞其纖維素和半纖維素之間的糖苷鍵，降低聚合度，然后通過選用酵母菌和乳酸菌混合菌種進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，研究發(fā)酵工藝參數(shù)對(duì)產(chǎn)物蛋白含量的影響，以期生產(chǎn)出營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的單細(xì)胞蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 材料 酵母菌和乳酸菌，由河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻殼粉的預(yù)處理 凱氏定氮法測(cè)定初始稻殼粉中真蛋白質(zhì)含量為5.89%。稱取一定量的稻殼粉，按照 1∶15（m/V）加入 1%NaOH 溶解，微波處理20 min后濾干，蒸餾水洗滌至中性，烘干，待用。

1.2.2 菌種活化試驗(yàn) 按照菌種配比稱取酵母菌粉和乳酸菌粉后加入一定量的紅糖水，適宜條件下活化后待用。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 分別考查菌種配比、接種量、尿素添加量、水分含量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 本試驗(yàn)在酵母菌粉與乳酸菌粉混合配比2∶1，尿素添加量1.0%（m/m）的條件下，選取了接種量、水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，對(duì)混合菌種固態(tài)發(fā)酵稻殼粉的工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化。

本次研究中，每組試驗(yàn)在不同條件下重復(fù)三次，取三次平行試驗(yàn)的平均值作為最終結(jié)果，通過IBM SPSS Statistics 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 測(cè)定指標(biāo)及方法 將發(fā)酵好的稻殼粉低溫烘干，測(cè)定真蛋白含量（司翔宇和葛蕾，2005）。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 酵母菌和乳酸菌菌種配比對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響 由圖1可知，當(dāng)接種比例由3∶1調(diào)整為2∶1后，真蛋白含量有明顯的提高，之后隨著接種比例的變化真蛋白含量開始下降，試驗(yàn)接種配比為2∶1時(shí)，真蛋白含量最大，為22.08%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，菌種配比對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響顯著（P＜0.05），菌種配比的變化可能影響發(fā)酵過程氧氣含量的變化進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)與代謝，因此酵母菌和乳酸菌混合比例選擇2∶1。

圖1 菌種配比對(duì)真蛋白含量的影響

2.2 尿素添加量對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響由圖2可以看出，當(dāng)尿素添加量由0%提高至1.0%時(shí)，真蛋白增長(zhǎng)率較大，由9.32%增加為20.63%，而尿素添加量提高至2%時(shí)，真蛋白含量為21.76%，增加幅度不大。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，尿素添加量對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。尿素添加量為1.0%、1.5%、2.0%時(shí)，三者比較差異不顯著（P＞0.05），但尿素添加量為1.0%與0%、0.5%添加量比較，差異顯著。因此尿素添加量選擇1.0%。

2.3 接種量對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響 由圖3可知，當(dāng)接種量為0.25%時(shí)，真蛋白含量達(dá)到最大，為21.78%，增加接種量，真蛋白含量不增加反而下降，接種量為0.45%時(shí)，真蛋白含量為21.70%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，接種量對(duì)發(fā)酵影響極顯著（P＜0.01）。接種量的多少影響菌種的發(fā)酵周期，當(dāng)接種量偏大，菌種生長(zhǎng)迅速造成代謝產(chǎn)物積累，進(jìn)而產(chǎn)生反饋抑制，同時(shí)部分代謝產(chǎn)物會(huì)影響傳質(zhì)和水分分布；接種量偏小，菌種達(dá)到對(duì)數(shù)期時(shí)間延長(zhǎng)，增加菌種變異風(fēng)險(xiǎn)，不利于菌體生長(zhǎng)。因此接種量選0.25%。

圖2 尿素添加量對(duì)真蛋白含量的影響

圖3 接種量對(duì)真蛋白含量的影響

2.4 水分含量對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響由圖4數(shù)據(jù)可以看出，水分含量由30%增加至50%時(shí)，真蛋白含量相應(yīng)由18.71%增加至24.46%，隨著水分含量繼續(xù)升高至60%，真蛋白含量下降至22.21%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，水分含量對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響極顯著（P＜0.01）。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中水分含量過少，會(huì)延緩或阻礙菌體生長(zhǎng)代謝；水分含量過多，物料粘結(jié)容易引起菌體酸敗腐壞，因此培養(yǎng)基水分要選擇適當(dāng)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果水分含量選擇50%。

圖4 水分含量對(duì)真蛋白含量的影響

2.5 發(fā)酵溫度對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響由圖5可以看出，發(fā)酵溫度由28℃上升至36℃中，真蛋白含量變化不大，含量從21.36%增加至21.91%。由36℃增加到40℃后，真蛋白含量明顯下降，含量為16.75%，因此選擇28℃作為發(fā)酵溫度。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響顯著（P＜0.05）。溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)起著非常重要的作用，發(fā)酵結(jié)果的好壞也受溫度的控制。溫度過低時(shí)，菌種生長(zhǎng)緩慢，真蛋白含量增加較少；溫度過高時(shí)，不僅會(huì)抑制菌種生長(zhǎng)還會(huì)增加雜菌感染的幾率。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)真蛋白含量的影響

2.6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)稻殼粉中真蛋白含量的影響由圖6可以看出，發(fā)酵時(shí)間從3 d增加到4 d時(shí)，真蛋白含量增加幅度最大，由19.09%增加至22.56%，發(fā)酵時(shí)間為5 d效果最好。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響顯著 （P＜0.05）。發(fā)酵時(shí)間為5 d時(shí)真蛋白含量達(dá)到最大值22.84%，繼續(xù)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間，真蛋白含量出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，可能是菌種由平穩(wěn)期進(jìn)入衰亡期，開始出現(xiàn)自溶現(xiàn)象，同時(shí)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的消耗及物料酸堿性的變化也會(huì)抑制細(xì)胞蛋白的形成。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵時(shí)間為4 d和5 d時(shí)真蛋白含量差異不顯著，綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本及真蛋白含量變化不大的情況下，發(fā)酵時(shí)間適當(dāng)延長(zhǎng)各種消化酶和維生素等產(chǎn)物會(huì)隨之增加，因此發(fā)酵天數(shù)選擇5 d。

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)真蛋白含量的影響

2.7 正交試驗(yàn) 在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酵母菌∶乳酸菌為2∶1的組合菌種，進(jìn)一步對(duì)該混合菌種的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。選擇接種量、水分含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)影響因素進(jìn)行L9（34）四因素三水平正交試驗(yàn)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

通過表2可以看出4個(gè)因素的最優(yōu)水平分別為0.25%、40%、32℃和5 d，即發(fā)酵工藝的優(yōu)化組合為A1B1C2D2。由表3可以看出接種量、水分含量對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中蛋白含量影響最大的因素是水分含量，發(fā)酵時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），而發(fā)酵溫度對(duì)其影響不顯著（P＞0.05），影響程度大小順序?yàn)锽＞A＞D＞C，即水分含量＞接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度。因此發(fā)酵條件最終確定為：接種量0.25%（m/m），水分含量 40%（m/m），發(fā)酵溫度 32℃，發(fā)酵時(shí)間5 d。在該工藝條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)得真蛋白含量為26.19%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與結(jié)論

以堿液處理過的稻殼粉為原料，按照1.0%（m/m）添加尿素后，接種酵母菌與乳酸菌固態(tài)發(fā)酵。通過本試驗(yàn)優(yōu)化研究，統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析表明，真蛋白含量與水分含量和接種量有著極顯著相關(guān)性，正交試驗(yàn)中4個(gè)因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果的影響順序?yàn)椋核趾浚窘臃N量＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度，確定發(fā)酵工藝條件為：尿素添加量1.0%（m/m），接種量 0.25%（m/m），水分含量 40%（m/m），發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵時(shí)間5 d，在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，蛋白含量由最初的5.89%上升到26.19%。試驗(yàn)通過優(yōu)化發(fā)酵工藝條件，使菌體蛋白含量最大化，增加稻殼粉中真蛋白含量，提高了稻殼粉飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

目前利用玉米秸稈、馬鈴薯渣等纖維含量高的物質(zhì)作為原料進(jìn)行生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的研究較多 （姜心，2010；祝英等，2009；王興華等，2008），而有關(guān)稻殼粉接種混合菌發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的研究較少。本試驗(yàn)利用物化方法先將稻殼粉粉碎后進(jìn)行堿處理，初步分解稻殼粉中難吸收的纖維素類物質(zhì)，用NaOH處理稻殼粉能破壞其木質(zhì)素結(jié)構(gòu)，促進(jìn)木質(zhì)纖維原料的膨脹，增加內(nèi)部表面積，降低其聚合度，從而有利于酵母菌和乳酸菌的生長(zhǎng)發(fā)酵?；旌暇N發(fā)酵稻殼粉既可以利用酵母菌兼性厭氧發(fā)酵的特性，為乳酸菌的發(fā)酵制造無氧環(huán)境，又可以結(jié)合乳酸菌生長(zhǎng)產(chǎn)酸的特性降低原料pH值，抑制雜菌的生長(zhǎng)，充分利用稻殼粉中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞蛋白。

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