詹湉湉，柯芙容，陳慶達，張少華，許麗惠，王全溪，王長康

(1.福建農林大學動物科學學院，福建 福州350002;2.晉江市綠色保健蛋品有限公司，福建 晉江362200)

隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的快速發(fā)展，對豆粕的需求越來越大.但豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑、植物血球凝集素、脲酶、大豆抗原蛋白、低聚糖和植酸等抗營養(yǎng)因子，大大降低了豆粕的利用率[1].如何提高豆粕的利用率是急需解決的重大問題.去除豆粕中抗營養(yǎng)因子的方法主要有物理、化學和生物學方法.物理法主要采用高溫膨化，效果好，但能源消耗大、成本高;化學法主要采用適當的化學試劑處理豆粕，雖有一定效果，但易使化學物質殘留，污染環(huán)境，且工藝較復雜，而且營養(yǎng)成分易被破壞，導致豆粕營養(yǎng)價值降低;生物學方法主要采用生物育種和生物學技術對豆粕進行處理，目前在國內外研究較多[2－3].

采用微生物發(fā)酵豆粕，已被證明是一種有效降低和去除抗營養(yǎng)因子的方法[4－5].發(fā)酵豆粕是利用現(xiàn)代生物工程技術生產的低抗營養(yǎng)因子[6]的優(yōu)質蛋白質飼料，將大分子蛋白質酶解成多肽、小肽及游離氨基酸[7]，同時含有大量的益生菌、乳酸菌及未知生長因子等物質[8].影響豆粕發(fā)酵的因素很多，而國內外關于豆粕發(fā)酵適宜菌種的選擇及發(fā)酵工藝參數的研究才剛起步[9－10]，且目前研究報道多為單一菌種或混合菌種對發(fā)酵豆粕抗營養(yǎng)因子的影響，在發(fā)酵豆粕營養(yǎng)特性上的研究不多.為了進一步研究混合菌種發(fā)酵對豆粕品質的影響，本試驗采用凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕，研究發(fā)酵時間和料水比對發(fā)酵豆粕營養(yǎng)成分的影響，確定豆粕適宜的發(fā)酵參數，旨在為微生物發(fā)酵豆粕的研究與應用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 材料

發(fā)酵劑由福建廈門洛東生物環(huán)?？萍加邢薰咎峁心Y芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌，總活菌數為1×109cfu·g－1.其中，凝結芽孢桿菌活菌數為2×108cfu·g－1，枯草芽孢桿菌活菌數為5×108cfu·g－1，酵母菌活菌數為3 ×108cfu·g－1.

豆粕購于廈門中禾實業(yè)有限公司，粗蛋白質含量為43.13%，水分含量為12.17%.

發(fā)酵豆粕基礎配方組成:100 kg豆粕+1 kg玉米+水+20 g菌種.

1.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

試驗采用單因素處理，由發(fā)酵時間優(yōu)化和發(fā)酵水分優(yōu)化兩部分組成，兩個發(fā)酵過程均需要密封，發(fā)酵袋保持一定的高度，室溫為35℃左右.

1.2.1 發(fā)酵時間優(yōu)化 試驗設兩個水平，每個水平3個重復，在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基上，室溫厭氧分別發(fā)酵48和72 h.

1.2.2 發(fā)酵水分優(yōu)化 試驗設3個水平，每個水平3個重復，在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基上，加水量分別為40、55和 70 kg，即料水比分別為 1∶0.40、1∶0.55 和 1∶0.70，室溫下厭氧發(fā)酵 72 h.發(fā)酵 72 h 后，測得發(fā)酵豆粕中的含水量分別為 37.85% 、44.27% 和 49.19%.

1.3 指標測定

1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定 水分和粗蛋白質含量按常規(guī)方法[11]測定;游離氨基酸含量采用甲醛滴定法[12]測定;酸溶性蛋白質含量采用三氯乙酸(TCA)法[13]測定;單寧酸溶性蛋白質含量采用單寧沉淀法[12]測定.

多肽和寡肽含量通過計算得出.多肽含量=酸溶性蛋白質含量－游離氨基酸含量;寡肽含量=單寧酸溶性蛋白質含量－游離氨基酸含量.

1.3.2 pH測定 pH采用玻璃電極pHS-3C型pH計測定.

pH測定的具體步驟:準確稱取1 g樣品和9 g蒸餾水(采用移液槍準確移取9 mL蒸餾水)，振蕩、搖勻后用pH計測定.

1.3.3 活菌含量的測定 活菌總數采用稀釋平板計數法[14]測定.

1.4 數據處理

原始數據經Excel 2003軟件處理后，采用SPSS 16.0軟件進行分析.其中，發(fā)酵時間優(yōu)化的數據采用成組樣本T檢驗，發(fā)酵水分優(yōu)化的數據采用單因素方差分析.差異顯著后進行LSD多重比較，結果用平均值±標準差表示.

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕品質的影響

2.1.1 對常規(guī)營養(yǎng)成分的影響 從發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分的影響(表1)可以看出，發(fā)酵72 h組與發(fā)酵48 h組相比，其游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著提高(P＜0.01)，其他指標均有提高，但差異不顯著(P＞0.05).可見，發(fā)酵72 h的效果比發(fā)酵48 h的效果好.

2.1.2 對pH和活菌數的影響 從發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕pH和活菌數的影響(表2)可以看出，發(fā)酵72 h組與發(fā)酵48 h組相比，其pH極顯著降低(P＜0.01)，而活菌數未出現(xiàn)明顯變化(P＞0.05).可見，發(fā)酵72 h的效果比發(fā)酵48 h的效果好.

表1 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分(絕干物質基礎)的影響1)Table 1 Effects of fermentation time on nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2 料水比對發(fā)酵豆粕品質的影響

2.2.1 對常規(guī)營養(yǎng)成分的影響 從料水比對發(fā)酵豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分的影響(表3)可以看出，與料水比為1∶0.40 組相比，料水比為1∶0.55 組的游離氨基酸、寡肽、游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著提高(P＜0.01)，寡肽/粗蛋白質顯著提高(P ＜0.05).與料水比為 1∶0.40 和1∶0.55組相比，料水比為 1∶0.70 組的游離氨基酸/粗蛋白質、寡肽、寡肽/粗蛋白質和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著提高(P＜0.01);游離氨基酸顯著高于料水比為 1∶0.40 組(P ＜0.05)，與料水比為 1∶0.55 組的差異不顯著(P ＞0.05);多肽和多肽/粗蛋白質極顯著高于料水比為1∶0.40 組(P ＜0.01)，與料水比為 1∶0.55 組的差異不顯著(P ＞0.05);游離氨基酸 +寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40 組(P ＜0.01)，顯著高于料水比為1∶0.55 組(P ＜0.05).

表2 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕pH和活菌數的影響1)Table 2 Effects of fermentation time of soybean meal on pH and viable counts

表3 料水比對發(fā)酵豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分(絕干物質基礎)的影響1)Table 3 Effects of material-water ratio on the nutritional composition of soybean meal(dry matter basis) %

2.2.2 對pH和活菌數的影響 從料水比對發(fā)酵豆粕pH和活菌數的影響(表4)可以看出:與料水比為 1∶0.40 組相比，料水比為 1∶0.70 和 1∶0.55 組的pH極顯著降低(P＜0.01)，活菌數顯著提高(P＜0.01);與料水比為 1∶0.55 組相比，料水比為 1∶0.70組的pH極顯著降低(P＜0.01).可見，料水比為1∶0.70的發(fā)酵效果最優(yōu).

表4 料水比對發(fā)酵豆粕pH和活菌數的影響1)Table 4 Effects of material-water ratio of soybean meal on pH and viable counts

3 討論

3.1 發(fā)酵時間對發(fā)酵豆粕品質的影響

發(fā)酵終點對提高產物的生產率有非常重要的意義.在發(fā)酵過程中，產物的濃度是變化的，一般產物高峰生長階段時間越長，生產率就越高，但到一定時間后生產率提高緩慢，甚至下降.因此無論是獲得菌體還是代謝產物，微生物發(fā)酵都有一個最佳時間.時間過短，不足以獲得所需的產量以及優(yōu)質發(fā)酵產品;時間過長，由于環(huán)境已不利于菌體生長，往往造成菌體自溶，產量下降，同時增加生產成本.本試驗結果顯示，發(fā)酵72 h組的游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著高于發(fā)酵48 h組，pH極顯著低于發(fā)酵48 h組.表明凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳時間為72 h，與李文立等[15]和莫重文等[16]的研究結果一致.同樣，朱曦等[9]研究表明，發(fā)酵時間為72 h時，豆粕中的抗營養(yǎng)因子能有效地被去除;朱平軍等[17]研究也表明，最佳發(fā)酵時間為72 h，黑曲霉發(fā)酵豆粕中的酸溶蛋白質含量由發(fā)酵前的1.75%提高到13.62%.以上研究結果均表明發(fā)酵72 h的效果好，這可能是因為隨著發(fā)酵時間的延長，豆粕發(fā)酵更加徹底.本試驗結果與邢力等[18]和胡瑞等[19]的“48 h為最適發(fā)酵時間”研究結果不同.由于影響豆粕發(fā)酵的因素很多，而且評定指標也不盡相同，因此研究結果也存在一定的差異，尤其是在菌種選擇、發(fā)酵的工藝參數以及對豆粕營養(yǎng)價值影響的研究結果差異較大.可見，發(fā)酵時間一定要根據不同的菌種、工藝條件和產物，通過試驗來確定.

3.2 料水比對發(fā)酵豆粕品質的影響

固態(tài)發(fā)酵基質的含水量是決定固態(tài)發(fā)酵成功與否的關鍵因素之一.基質含水量高，容易導致基質多孔性降低，減少基質內氣體，但能增加營養(yǎng)成分和菌體的流動性;而含水量低，造成基質膨脹程度低，菌體生長受抑制，酶產量下降.基質含水量不僅影響微生物的生長，還影響發(fā)酵系統(tǒng)中氧氣的供應、氣體交換等活動，關系到發(fā)酵的成敗.本試驗綜合各項指標可得，采用凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳料水比為1∶0.70.這一研究結果與王德培等[20]的研究結果類似，與王平[21]和高愛琴等[22]的“最佳發(fā)酵料水比為1∶0.6和3∶2”研究結果也相近.本試驗結果表明:料水比為1∶0.70組的游離氨基酸和活菌數顯著高于料水比為1∶0.40組;游離氨基酸/粗蛋白質、寡肽、寡肽/粗蛋白質和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著高于料水比為 1∶0.40 和1∶0.55 組;pH 極顯著低于料水比為 1∶0.40 和 1∶0.55 組;多肽、多肽/粗蛋白質和游離氨基酸+寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40組，高于料水比為1∶0.55組(差異不顯著).朱曦等[9]研究表明:料水比為1∶(0.8－1.0)時，豆粕中的抗營養(yǎng)因子能有效被去除;此外，胡瑞等[19]研究表明:發(fā)酵后，料水比為1∶0.6組除揮發(fā)性鹽基氮含量外，其他指標均優(yōu)于料水比為1∶0.40組，但揮發(fā)性鹽基氮含量偏高，因此選擇1∶0.40為最適發(fā)酵料水比.陳炳鈿等[23]研究表明，最佳發(fā)酵工藝條件為:地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和嗜酸乳桿菌的配比為(2∶1∶1)×109，接種量為10%，含水量為45%，采用好氧48 h、厭氧24 h的固態(tài)發(fā)酵工藝.以上研究結果存在差異的原因可能與菌種、發(fā)酵工藝以及測定指標等不同所致.因此，適合的料水比一定要根據不同菌種和發(fā)酵條件等，通過試驗來確定.

3.3 微生物發(fā)酵可以顯著提高豆粕的品質

3.3.1 微生物發(fā)酵對豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分的影響 本試驗中，豆粕經微生物發(fā)酵后，豆粕中粗蛋白質的總量無顯著變化，但蛋白質組成發(fā)生了改變，大、中分子蛋白質水平降低了，小肽和游離氨基酸的水平提高了，改善了豆粕的營養(yǎng)價值，這一結果與陳中平等[24]的研究結果一致，而且發(fā)酵豆粕的pH和活菌數也有顯著性變化.豆粕在發(fā)酵過程中，原料豆粕中的真蛋白質在枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和酵母菌分泌的眾多酶系作用下，由大分子蛋白質分解為小分子蛋白質，有序地降解為多肽以及大量具有特殊生理活性的小肽和游離氨基酸等，這就使得發(fā)酵豆粕中的小肽和游離氨基酸含量增加.

研究表明，微生物發(fā)酵可以把蛋白質水解為氨基酸、多肽和小肽等小分子物質，提高蛋白質的利用率[25].Hong et al[5]研究表明，豆粕發(fā)酵后，豆粕中的大分子蛋白質降解為小分子肽;馬文強等[3]研究表明，發(fā)酵后豆粕中的大分子蛋白質含量較發(fā)酵前降低了75.57%，中分子蛋白質含量較發(fā)酵前降低了86.7%，小分子蛋白質含量較發(fā)酵前提高了2.25倍.雖然前人的研究存在差異，但發(fā)酵均不同程度地改善了豆粕品質.本試驗結果表明，豆粕在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌和酵母菌分泌的眾多酶系也有效地將豆粕中的大分子蛋白質降解為小分子蛋白質.

3.3.2 微生物發(fā)酵對pH和活菌數的影響 豆粕經發(fā)酵后，具有濃郁的酸香味，提高豆粕的適口性.許多研究表明，pH為4.5－5.5，會明顯提高飼料的誘食性.

豆粕發(fā)酵后除會提高常規(guī)營養(yǎng)成分外，還含有有益微生物及其代謝產物.由于在豆粕發(fā)酵過程中加入了有益微生物，因此發(fā)酵后的物料中含有大量有益微生物種群，其種類主要取決于發(fā)酵前物料中所添加的微生物，常見的有芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌，這些益生性微生物對于環(huán)境和畜禽的健康均具有非常重要的作用.陳文靜[26]對發(fā)酵后的豆粕進行測定，發(fā)現(xiàn)乳酸菌數達到107cfu·g－1;康立新[27]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中微生物代謝產生的有效活菌數達到4.20×108cfu·g－1.本試驗對發(fā)酵后的豆粕進行測定，其活菌含量也有極顯著提高，活菌數達到2.54×109cfu·g－1.

4 結論

本試驗結果顯示:發(fā)酵72 h組的游離氨基酸+寡肽和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著高于發(fā)酵48 h組，pH極顯著低于發(fā)酵48 h組;料水比為1∶0.70組的游離氨基酸和活菌數顯著高于料水比為1∶0.40組，游離氨基酸/粗蛋白質、寡肽、寡肽/粗蛋白質和(游離氨基酸+寡肽)/粗蛋白質極顯著高于料水比為1∶0.40 和 1∶0.55 組，pH 極顯著低于料水比為1∶0.40 和1∶0.55 組，多肽、多肽/粗蛋白質和游離氨基酸+寡肽極顯著高于料水比為1∶0.40組.本試驗得出的凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌混合菌種發(fā)酵豆粕的最佳工藝條件為:凝結芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母菌的配比為(2∶5∶3)×108，料水比為1∶0.70(即含水量為 49.19%)，接種量為 0.02%，厭氧發(fā)酵 72 h.

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