毛敬潔 李鉆芳 林如輝 卓沛元 張穎錚

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 福州350122）

阿爾海默病（Alzheimer Disease，AD）是老年期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知障礙和神經(jīng)精神異常，以大腦皮質(zhì)廣泛性萎縮出現(xiàn)大量的β淀粉樣蛋白（β-amyloid Protein，Aβ）沉積形成的老年斑（Senile Plaque，SP）和異常過度磷酸化tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillary Tangle，NFT）為典型的病理變化。發(fā)病機(jī)制涵蓋遺傳、環(huán)境危險(xiǎn)因子、多種基因及致病蛋白的改變。目前認(rèn)為中樞神經(jīng)遞質(zhì)代謝障礙、APP基因突變、Aβ多肽沉積、tau蛋白過度磷酸化、炎癥、氧化應(yīng)激、異常的細(xì)胞周期/凋亡等是AD的主要發(fā)病機(jī)制[1～2]。APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠被認(rèn)為是可模擬AD自然病理生理過程的理想動物模型[3～4]。眾所周知，轉(zhuǎn)基因鼠價(jià)格較高，為本課題研究認(rèn)知障礙提供足夠的動物模型，從南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街行馁徣肓薃PP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠純合子雄性2只和野生型雌鼠2只進(jìn)行繁殖。根據(jù)遺傳規(guī)律所獲后代有1/4的機(jī)率為陰性純合子，所以在使用前必須進(jìn)行基因型檢測?，F(xiàn)將這批小鼠的飼養(yǎng)、繁殖及鑒定過程報(bào)道如下：

1 材料和儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 由南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ街行奶峁〣6C3-Tg（APPswe，PSEN1dE9 85Dbo/J品系。雙轉(zhuǎn)基因小鼠純合體雄性種鼠2只及同窩陰性雌性鼠2只，繁殖所產(chǎn)生后代50只1～4月齡，分籠喂養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，SPF級。

1.2 主要試劑 小鼠組織基因組DNA提取試劑盒購自Biospin公司；引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成。100 bp marker（杭州博日科技有限公司）；PCR Master Mix（2X）[加拿大（中國）Fermenta公司]；瓊脂糖（美國 Bio-west公司）；Gold View 染料（上海賽百盛基因技術(shù)有限公司）；6 X Loadin Buffer、5 X TBE（上海捷瑞生物工程有限公司）。無水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠分析純）。

1.3 主要儀器 G-STORMGSI梯度PCR儀（英國GRI公司），Gel DOC 2000型凝膠成像分析系統(tǒng)APC電泳儀、水平式電泳槽（美國Bio-Rad公司）DU-650型蛋白核酸分析儀（美國Beckman公司）5417R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。

2 方法

2.1 飼養(yǎng)與繁殖法 實(shí)驗(yàn)動物遵照國家實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)和使用指南，溫度：（22±1）℃，濕度：50%，12 h/12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。小鼠的可配期為3～10個(gè)月，母鼠的妊娠期為20 d左右，繁殖采用一只雄鼠與一只雌鼠同居的方式進(jìn)行。新生鼠出生后前5 d不換墊料，第19～20天后子鼠雌雄分籠飼養(yǎng)。

2.2 基因鑒定方法

2.2.1 剪鼠尾 當(dāng)新生的小鼠年齡達(dá)到2～3周（耳朵已經(jīng)長開）時(shí)剪鼠尾較好，鼠尾剪去長度不得超過0.5 cm。此時(shí)剪尾一方面避免了在幼崽出生后一周打擾帶乳母鼠，防治母鼠的吃仔現(xiàn)象；另外這時(shí)的小鼠容易抓取，體毛尚未生長，小鼠的出血較少恢復(fù)力比較強(qiáng)，提取DNA的質(zhì)量較好。剪鼠尾后即對小鼠標(biāo)記，一般情況下一籠小鼠不會超過10只，采用左右耳朵打洞的方法來標(biāo)記，依次標(biāo)記為左1、右1、左2、右 2、左 1 右 1、左 2 右 1、左 1 右 2、左 2 右 2、左3，最后一只不打洞。

2.2.2 DNA提取和定量 剪取小鼠尾巴0.5 cm放入編號的EP管中，投入液氮冷卻后研磨，取50 mg粉末放入1.5 ml離心管。用Biospin組織基因組DNA提取試劑盒提取DNA。在50 mg組織中加入600 μl的RL Buffer用1 ml的Tip頭輕輕吹打混合均勻后，于6 000 r/min離心1 min，棄上清；加10 μl PK Solution和200 μl LT Buffer混合均勻；于56℃環(huán)境中溫浴90 min，移出加400 μl GA Buffer混勻；12 000 r/min離心2 min，將上清液轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的1.5 ml離心管；加300 μl的G Binding Buffer和50 μl無水乙醇混合均勻；將混合液體分2次轉(zhuǎn)移至Spin column，6 000 r/min離心30 s，棄去接液管內(nèi)液體；向 Spin column中加入 500 μl的 G Binding Buffer，10 000 r/min離心30 s，棄去接液管內(nèi)液體；向 Spin column 中 加 入 600 μl的 Wash Buffer，10 000 r/min離心30 s，棄去接液管內(nèi)液體；重復(fù)1次；再次將Spin column10 000 r/min離心1 min，將Spin column轉(zhuǎn)移到1個(gè)新的1.5 ml離心管；向Spin column 中加 100 μl至 200 μl Elution Buffer，室溫溫育 1 min；12 000 r/min離心 1 min，并棄 Spin column；1.5 ml離心管中液體含有DNA。

2.2.3 引物合成設(shè)計(jì) 引物序列設(shè)計(jì)如下：APP正義鏈：5′-GAC TGA CCA CTC GAC CAG GTT CTG-3′，反義鏈：5′-CTT GTA AGT TGG ATT CTC ATA TCC-3′；APP產(chǎn)物大小為344 bp。PS1正義鏈：5′-AAT AGA GAA CGG CAG GAG CA-3′，反義鏈：5′-GCC ATG AGG GCA CTA AT AT-3′；PS1產(chǎn)物大小為608 bp。反應(yīng)體系20 μl擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，59℃退火40 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 1 min。GAPDH 正義鏈：5′-AAA TGG TGA AG TCG GTG TGAA C-3′，反義鏈：5′-CAA CA TCT CCA CTT TGC CAC TG-3′；產(chǎn)物大小為9 bp。反應(yīng)體系20 μl，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性min，94℃變性 30 s，59 ℃退火 40 s，72 ℃延伸min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行光密度掃描，用凝膠成像分析系統(tǒng)Quantity one進(jìn)行觀察分析。

3 結(jié)果

3.1 小鼠繁殖及分辨年齡 每次生產(chǎn)6～10只，周后小鼠跳籠活躍，平均每籠只能飼養(yǎng)4～5只。小鼠整個(gè)身體粉紅且腹部無奶時(shí)，為前一晚出生或出生當(dāng)天；小鼠腹部有一小團(tuán)白色物質(zhì)，為出生2～d；當(dāng)小鼠背部長出皮毛時(shí)，為出生3～4 d；當(dāng)小鼠毛長全，但眼睛未睜開時(shí)，為出生10 d左右；當(dāng)小鼠眼睛剛開，耳朵未開時(shí)，此小鼠為出生12 d左右；當(dāng)小鼠耳朵剛開時(shí)，為出生14 d左右。2～3周是剪鼠尾基因鑒定的最佳期間。

3.2 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定 以基因組DNA為模板擴(kuò)增，可見在9只小鼠中均擴(kuò)增出約100 bp大小條帶陽性對照內(nèi)參基因GAPDH，其中 3 只小鼠（1、2、3）基因組 DNA 擴(kuò)增出約350 bp及約600 bp大小的條帶，與預(yù)計(jì)所擴(kuò)增的APP及PS1基因大小一致。鑒定結(jié)果見圖1。

圖1 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因表型的鑒定

4 討論

阿爾海默病可分為家族性（FAD）和散發(fā)性或遲發(fā)性（SAD/LOAD）。FAD為常染色體顯性遺傳病，僅占全部AD的15%以下，而LOAD沒有明顯的遺傳背景，目前研究認(rèn)為發(fā)病主要與β淀粉樣前體蛋白（APP）基因及早老素蛋白（PS）遺傳基因突變有關(guān)[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)PS主要集中在海馬和皮層內(nèi)。PS是一種跨膜蛋白，可在細(xì)胞中與APP形成復(fù)合物，參與APP轉(zhuǎn)運(yùn)及合成后加工。1995年Games等首次報(bào)道成功將人突變型淀粉樣蛋白前體APP基因轉(zhuǎn)入小鼠后，AD轉(zhuǎn)基因動物模型成為AD研究熱點(diǎn)[6]。雖然APP轉(zhuǎn)基因動物出現(xiàn)類似AD患者的大腦改變，但是APP突變轉(zhuǎn)基因模型出現(xiàn)病理學(xué)及行為學(xué)改變均較晚。PS1基因位于14號染色體上，參與APP轉(zhuǎn)運(yùn)及合成后的加工。在阿爾海默病中APP突變只占AD患者的1%～3%[7]，PS基因突變的患者則高達(dá)40%～50%，70%～80%早發(fā)家族AD是由PS1基因突變所致，PS1基因繼APP之后重要的AD相關(guān)基因[8]。2000年Wengenack等[9]制作了APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠，表達(dá)人突變的PS基因和APP基因，12周后在轉(zhuǎn)基因鼠皮質(zhì)和海馬發(fā)現(xiàn)Aβ沉積，而且Aβ的量多伴有神經(jīng)元改變和突觸丟失及年齡有關(guān)的神經(jīng)行為學(xué)功能障礙，標(biāo)志著AD轉(zhuǎn)基因動物模型研究進(jìn)入了新的階段。APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型因較好地模擬了AD的病理特征和漸進(jìn)性病程，亦被世界公認(rèn)為常用的AD疾病模型[10]。

轉(zhuǎn)基因動物模型是當(dāng)今研究臨床疾病的熱點(diǎn)模型，本文總結(jié)了AD模型APP/PS1基因鼠的繁殖進(jìn)程和基因鑒定?；蜩b定目前提取鼠尾DNA的方法有很多種，以高鹽提取法和酚/氯仿提取法為實(shí)驗(yàn)室常用2種方法。其中高鹽提取法快捷，但提取到的DNA質(zhì)量有時(shí)不能滿足特定品系鑒定的需要，改用酚/氯仿法提取[11]。Biospin組織基因組提取試劑盒采用的是酚/氯仿法提取法。本研究從南京大學(xué)模式動物研究所購入了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠2只進(jìn)行繁殖，由于要求配對雌鼠是同窩陰性野生鼠，根據(jù)遺傳規(guī)律所獲后代有1/4的機(jī)率為陰性純合子，所以在下一步實(shí)驗(yàn)前必須進(jìn)行基因檢測，以區(qū)分AD轉(zhuǎn)基因型和野生型（同窩陰性）小鼠。本研究50只子代小鼠基因組DNA中31只小鼠基因組DNA擴(kuò)增出300 bp的APP條帶和600 bP的PS1條帶。證明APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的飼養(yǎng)和繁殖獲得成功，獲得了較多的成功轉(zhuǎn)入APP/PS1基因的純合子小鼠。因此正確飼養(yǎng)繁殖及利用PCR對AD模型鼠的繁殖小鼠進(jìn)行基因鑒定是獲得APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因純合子小鼠的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)成功繁殖及鑒定了APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的基因型，為課題組今后開展認(rèn)知障礙的研究提供了理想的AD動物模型。

[1]Hillmann A，Hahn S，Schilling S，et al.No improvement after chronic ibuprofen treament in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease[J].Neurobiol Aging，2012，33(4):833

[2]Wolf MS.When loss is gain:reduced presenilin proteolytic function leads to increased Abeta42/Abeta40.Talking Point on the role of presenilin mutations in Alzheimer disease[J].EMBO Rep，2007，8(2):136-140

[3]宋春未，戴雪伶，姜招峰.阿爾茨海默病實(shí)驗(yàn)動物模型研究進(jìn)展[J].生物學(xué)雜志，2013，30(5):85-88

[4]Breyhan H，Wirths O，Duan K，et al.APP/PS1KI bigenic mice develop early synaptic deficits and hippocampus atrophy [J].Acta Neuropathol，2009，117(6):677-685

[5]Lee J，Chan SL，Mattson MP.Adverse effect of a presenilin-1 mutation in microglia results in enhanced nitric oxide and inflammatory cytokine responses to immune challenge in the brain[J].Neuromolecular Med，2002，2(1):29-45

[6]Games D，Adamms D，Alessandrini R，et al.Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F beta-amyloid precursor protein[J].Nature，1995，373(6514):523-527

[7]Tanzi RE，Bertram L.Twenty years of the Alzheimer’s disease amyloid hypothesis:a genetic perspetive [J].Cell，2005，120(4):545-555

[8]Strooper BD，Annaert W.Presenilins and the intramembrane protolysis of proteins:facts and fiction[J].Nat Cell Biol，2001，3(10):221-225

[9]Wengenack TM，Whelan S，Curran GL，et al.Quantitative histological analysis of amyloid deposition in Alzheimer's double transgenic mouse brain[J].Neuroscience，2000，101(4):939-944

[10]叢琳，張楠楠，佡劍非，等.甲基化芯片檢測APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠基因組DNA甲基化分布 [J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，44(2):160-163

[11]高翔.小鼠基因功能研究及疾病模型系列專題(二)—基因工程小鼠的品系管理及基因型鑒定[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32(2):193-194