孫小杰，宋佳，尹華濤

(1.南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210008；2.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，南京 210028；3.國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心,北京 100029)

食品添加劑喹啉黃作為人工合成食用色素，色澤鮮艷、價(jià)格低廉，故為食品生產(chǎn)廠家廣泛使用。喹啉黃為水溶性偶氮類(lèi)合成色素，在英國(guó)常用于冰糕、水果、蛋糕、巧克力、面包、奶酪醬、軟飲料等食品的著色。由于該色素可能導(dǎo)致兒童多動(dòng)癥，日本、美國(guó)及挪威禁用于食品，而我國(guó)僅允許在配制酒中添加，且最大使用量為0.1 g／L［1］，但我國(guó)食品中喹啉黃檢測(cè)的方法標(biāo)準(zhǔn)一直未能及時(shí)跟上，造成了喹啉黃檢測(cè)項(xiàng)目的缺失。

目前測(cè)定喹啉黃的文獻(xiàn)報(bào)道較少，阮麗萍等和楊富春等采用液相色譜法對(duì)食品中喹啉黃含量進(jìn)行了測(cè)定［2-3］，由于色譜條件的不同，喹啉黃部分組分由于未得到有效分離而造成色譜峰個(gè)數(shù)存在差異［4-5］，對(duì)于喹啉黃組成的探討也未見(jiàn)報(bào)道。已有報(bào)道的文獻(xiàn)中喹啉黃的定量都是以峰面積總和作為定量的基礎(chǔ)，而液相色譜易受到其它色素的干擾，無(wú)法滿足檢測(cè)的定性確證要求［6-7］。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LS-MS／MS)在著色劑分析領(lǐng)域的運(yùn)用發(fā)展迅速，彌補(bǔ)了液相色譜定性不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)。馬曉燕等和伊熊海等對(duì)于喹啉黃是以喹啉黃二鈉鹽來(lái)定量［8-9］，F(xiàn)eng Feng等研究是以喹啉黃作為一鈉鹽來(lái)定量［10］，而單獨(dú)測(cè)定喹啉黃一鈉鹽、二鈉鹽并不能準(zhǔn)確反映喹啉黃的實(shí)際含量。喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品為喹啉黃混合物，因此測(cè)定出喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)是準(zhǔn)確檢測(cè)喹啉黃的前提。筆者利用液相色譜對(duì)喹啉黃各組分進(jìn)行分離，通過(guò)質(zhì)譜法對(duì)各組分進(jìn)行定性，用峰面積歸一化法得出喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，為準(zhǔn)確檢測(cè)食品中喹啉黃的含量提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配有二極管陣列檢測(cè)器(DAD)，美國(guó)Agilent公司；

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1260 HPLC-6460 QQQ型，配有電噴霧離子源，美國(guó)Agilent公司；

電子天平：XS205型，瑞士Metler Toledo公司；

甲醇：色譜純，美國(guó)ROE公司；

乙酸銨：分析純，南京化學(xué)試劑股份有限公司；

喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度為97.5%，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

食品添加劑喹啉黃：印度VIDHI公司；

甲醇：色譜純，美國(guó)ROE公司；

實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)(0.22 μm過(guò)濾膜)過(guò)濾的超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱(chēng)取喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg于100 mL棕色容量瓶中，用純水溶解并定容，配制成1 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，室溫保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)根據(jù)實(shí)際需要再將其配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：A為0.01 mol／L乙酸銨水溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min，20% B，1.0～20.0 min，20%～90% B，20.0～22.0 min，90%～20.0% B，22.0～25.0 min，保持20% B；流量：1.0 mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣體積：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：415 nm。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：負(fù)離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；毛細(xì)管電壓：-4 000 V；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：5 L／min；霧化氣壓力：310 kPa(45 psi)；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流量：11 L／min；定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 喹啉黃的定性離子對(duì)、定量離子對(duì)、碎裂電壓、碰撞能量

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)取100.0 mg食品添加劑喹啉黃樣品至100 mL容量瓶中，用純水溶解并定容。用時(shí)根據(jù)實(shí)際需要再將其稀釋后過(guò)0.45μm水相濾膜，濾液上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 喹啉黃各組分的分離

2.1.1 HPLC條件的選擇及優(yōu)化

由于喹啉黃結(jié)構(gòu)中含有磺酸根基團(tuán)，乙酸銨溶液的存在可以促進(jìn)目標(biāo)物的保留和分離，改善峰形，加入不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著甲醇比例的增加，流動(dòng)相的極性逐漸減小，洗脫能力逐漸增強(qiáng)，兼顧到合適的保留時(shí)間和良好的色譜峰形，最終選擇甲醇初始比例為20%，流動(dòng)相采用梯度洗脫。喹啉黃4個(gè)組分的色譜峰的最大吸收波長(zhǎng)都在415 nm左右(見(jiàn)圖1)，且實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中無(wú)基質(zhì)干擾，因此選擇415 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 喹啉黃的光譜圖

2.1.2 喹啉黃的HPLC分析

分別以10 μg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液和食品添加劑喹啉黃溶液為研究對(duì)象，在1.3.1條件下對(duì)喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品和食品添加劑喹啉黃進(jìn)行分析，色譜圖分別見(jiàn)圖2及圖3。在該色譜條件下，喹啉黃4個(gè)組分完全分離，證明流動(dòng)相的選擇合理、分離效果好。結(jié)果表明：喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品和食品添加劑喹啉黃的色譜圖都存在4個(gè)主要的色譜峰，由于合成工藝的不同，由峰面積比較可以看出，喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品主要成分為后兩處峰的組分，而食品添加劑喹啉黃主要成分為前兩處峰的組分。

圖2 喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜圖

圖3 食品添加劑喹啉黃的HPLC色譜圖

2.2 喹啉黃各組分的定性分析

2.2.1 質(zhì)譜條件的選擇及優(yōu)化

首先采用LC-MS的SCAN模式，掃面范圍為50～500 m／z時(shí)，得到喹啉黃的特征母離子，然后分別優(yōu)化其母離子的出口毛細(xì)管處電壓，確定其響應(yīng)最大的出口毛細(xì)管處電壓，然后分別對(duì)其母離子進(jìn)行二次選擇性電離，通過(guò)優(yōu)化碰撞能量，選取適合檢測(cè)分析的子離子。

2.2.2 喹啉黃各組分的質(zhì)譜分析

以10 μg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對(duì)象，應(yīng)用LC-MS／MS對(duì)4個(gè)峰進(jìn)行驗(yàn)證，MRM色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 喹啉黃的MRM色譜圖

由圖4可知，MRM色譜圖中同樣出現(xiàn)4個(gè)色譜峰，喹啉黃一鈉鹽相對(duì)分子質(zhì)量為375，含一個(gè)SO3Na基團(tuán)，m／z 352.0為[M(375)-Na]模式；喹啉黃二鈉鹽相對(duì)分子質(zhì)量為477，含兩個(gè)SO3Na基團(tuán)，m／z 432.0為[M(477)-2Na+1H]模式。因此前兩處色譜峰為喹啉黃二鈉鹽的色譜峰，后兩處色譜峰為喹啉黃一鈉鹽的色譜峰。按保留時(shí)間的前后分別定義為QYNa2Ⅰ，QYNa2Ⅱ，QYNaⅠ，QYNaⅡ。

2.3 喹啉黃各組分的定量分析

2.3.1 HPLC法測(cè)定喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

以1.0 mg／mL的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液為研究對(duì)象，用峰面積歸一化法對(duì)4組峰積分得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并在相同情況下平行測(cè)定6次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 喹啉黃各組分的含量和精密度試驗(yàn) %

由表2可見(jiàn)，喹啉黃4個(gè)組分的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.09%，1.58%，1.25%，0.90%。說(shuō)明方法的精密度較高，重復(fù)性較好。

2.3.2 線性方程

喹啉黃的質(zhì)量濃度x在5.0～100.0 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系(r≥0.999 9)，以喹啉黃4種組分測(cè)量信噪比為S／N=3時(shí)的進(jìn)樣濃度定義為檢出限，結(jié)果列于表3。

表3 喹啉黃各組分的線性關(guān)系

2.3.3 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

通過(guò)向10.0 μg／mL的喹啉黃試樣溶液中添 加 低(5.0 μg／mL)、中(25.0 μg／mL)、高(50.0 μg／mL)3個(gè)濃度水平的喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 方法回收試驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，喹啉黃4個(gè)組分的回收率在98.2%～99.1%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%～1.14%，說(shuō)明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

建立了高效液相色譜檢測(cè)喹啉黃各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法，利用液相色譜法對(duì)喹啉黃各組分進(jìn)行了分離并進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)各組分進(jìn)行了定性研究。研究發(fā)現(xiàn)喹啉黃主要成分為喹啉黃一鈉鹽和二鈉鹽，同時(shí)各有兩種同分異構(gòu)體，利用峰面積歸一化法得到喹啉黃各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。基于食品基質(zhì)復(fù)雜，對(duì)于不同食品中喹啉黃檢測(cè)的前處理方法還需要做進(jìn)一步研究。

［1］GB 2760-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.

［2］楊富春，張寶元，陳丹萍.用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中4種色素［J］.江蘇調(diào)味副食品，2010，27(3): 12-14.

［3］阮麗萍，吉文亮，劉華良，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品中10種合成著色劑［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2011，23(2): 151-154.

［4］奚星林，邵仕萍，鄒志飛，等.高效液相色譜法檢測(cè)食品中的喹啉黃色素［J］.“食品安全質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)”試刊論文集，2008: 15-19.

［5］房寧，鞏俐彤，李倩.高效液相色譜測(cè)定預(yù)調(diào)酒中喹啉黃的方法［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜質(zhì)，2013，23(15): 3 049-3 053.

［6］劉泰然，趙海燕，羅仁才.超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定飲料中的17種食品添加劑［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2013，25(1): 44-48.

［7］李娜，李淑娟，安娟.快速液相色譜法測(cè)定食品中11種合成著色劑［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(1): 313-314.

［8］伊雄海，鄧曉軍，楊惠琴，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中的多種易濫用著色劑［J］.色譜，2011，29(11): 1 062-1 069.

［9］馬曉燕，朱順達(dá)，肖海龍，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中喹啉黃、酸性綠S和專(zhuān)利藍(lán)V［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12(4): 182-186.

［10］Feng Feng，Zhao Yansheng，Wei Yong， et al. Highly sensitive and accurate screening of 40 dyes in soft drinks by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography B，2011，879: 1 813-1 818.