陳偉珠，張怡評，方華，易瑞灶，朱芮琳，洪專

（1.國家海洋局第三海洋研究所，國家海洋局海洋生物資源綜合利用工程技術(shù)研究中心，福建廈門 361005；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 化學(xué)系，化學(xué)生物學(xué)福建省重點實驗室，福建廈門 361005）

硫酸氨基葡萄糖是由蝦、蟹甲殼降解分離得到的一種具有多種功能的高值產(chǎn)品，是一種分子結(jié)構(gòu)明確的天然氨基糖類化合物，是人體合成軟骨和關(guān)節(jié)液基質(zhì)硫酸軟骨素和膠原蛋白所必需的重要成分，可阻止關(guān)節(jié)軟骨退變，延緩病情進展，減輕關(guān)節(jié)腫痛，促進功能恢復(fù)［1–2］。硫酸氨基葡萄糖在治療骨關(guān)節(jié)炎癥狀方面達到了標(biāo)準(zhǔn)的非類固醇消炎藥物（布洛芬、保泰松等）相同的治療效果，還有病情控制作用，而沒有非類固醇消炎藥物的不良反應(yīng)，是預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎的特異性藥物，還是增強免疫功能的健康食品。硫酸氨基葡萄糖為醫(yī)食同源藥物，長期服用安全可靠，在應(yīng)用領(lǐng)域尚無已知的禁用規(guī)定，潛在著極大的醫(yī)藥開發(fā)價值。硫酸氨基葡萄糖目前是世界上公認的第一個預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀最為有效的膳食營養(yǎng)補充劑。歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟（EOLAR）指南中將硫酸氨基葡萄糖列為最高證據(jù)級別的推薦藥物［3］。

研究和開發(fā)與硫酸氨基葡萄糖相關(guān)的藥品、保健食品等產(chǎn)品一直是硫酸氨基葡萄糖開發(fā)研究領(lǐng)域的熱點和重點。目前市場上硫酸氨基葡萄糖相關(guān)產(chǎn)品品種繁多，含量參差不齊。產(chǎn)品中的有效成分硫酸氨基葡萄糖的含量高低是消費群體普遍關(guān)注的重點，也是產(chǎn)品研究開發(fā)方關(guān)注的重要技術(shù)問題。而硫酸氨基葡萄糖的含量測定需要有量值準(zhǔn)確可靠的硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品作為檢測基準(zhǔn)，但目前國內(nèi)外尚無硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品，為此筆者開展了硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制工作。

1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters Alliances系列（Waters 2695 separations Module型，Waters 2424 ELS Detector型），美國Waters 公司；

紫外可見分光光度計：HP–8452型，美國惠普公司；

紅外光譜儀：Nicolet Ftir-670型，美國Thermo Scientific 公司；

高分辨質(zhì)譜儀：Lct PremierTMXE型，美國Waters公司；

天平：AL／104型，瑞士梅特勒–托利多集團；

純水機：Milli-Q型，美國Milli-pore公司；

濃硫酸：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙腈：色譜純，德國默克公司；

實驗用水均由Milli–Q純水系統(tǒng)制得。

2 硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

以鹽酸氨基葡萄糖為原料，采用陰離子交換樹脂將氯離子置換為硫酸根離子，獲得硫酸氨基葡萄糖溶液，然后經(jīng)濃縮、干燥，得到硫酸氨基葡萄糖單體。

打開西林瓶蓋，稱取50 mg硫酸氨基葡萄糖，用超純水稀釋至100 mL，得質(zhì)量濃度為500 μg／mL的溶液，用色譜法進行純度檢測，每次進樣10 μL，每個樣品重復(fù)進樣3 次。

3 定性分析

采用紅外吸收光譜、高分辨質(zhì)譜及核磁共振譜等對硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進行定性分析。

3.1 紅外光譜分析

硫酸氨基葡萄糖的紅外光譜數(shù)據(jù)見表1。樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)說明結(jié)構(gòu)中存在羥基（－OH），亞甲基（－CH2），次甲基（－CH－），伯銨基（－NH3+），C－O，C－N，硫酸根離子等基團。

表1 硫酸氨基葡萄糖紅外光譜數(shù)據(jù)

3.2 高分辨質(zhì)譜分析

硫酸氨基葡萄糖中的氨基葡萄糖陽離子［C6H14NO5］+的理論精確質(zhì)量數(shù)為180.086 7，高分辨質(zhì)譜測得的硫酸氨基葡萄糖陽離子的精確質(zhì)量數(shù)為180.087 0，與氨基葡萄糖陽離子數(shù)據(jù)基本一致。

另外，氨基葡萄糖陽離子脫水后碎片［C6H12NO4］+的理論精確質(zhì)量數(shù)（162.076 1）與測得值（162.076 3）基本一致，雙分子氨基葡萄糖的陽離子［C12H27N2O10］+的理論精確質(zhì)量數(shù)（359.165 6）與測得值（359.166 7）也基本一致。

對該樣品進行核磁共振測試，測試數(shù)據(jù)見表2。

表2 硫酸氨基葡萄糖的核磁共振數(shù)據(jù)

硫酸氨基葡萄糖在重水(D2O)中的核磁數(shù)據(jù)顯示，δ5.31 (d，J=3.6 Hz)與δ4.82 (d，J=8.4 Hz)峰面積之比為3∶2，說明該化合物在水溶液中會發(fā)生α，β構(gòu)型的轉(zhuǎn)變，與文獻［4］一致。硫酸氨基葡萄糖在水溶液中達到平衡時，α，β兩種構(gòu)型（圖1）的比例為3∶2，這個數(shù)據(jù)決定了其它位置質(zhì)子數(shù)比例也為3∶2。核磁共振氫譜、碳譜表明樣品與硫酸氨基葡萄糖的結(jié)構(gòu)一致。

圖1 硫酸氨基葡萄糖的α，β構(gòu)型

綜上所述，樣品的紅外光譜、高分辨質(zhì)譜和核磁共振譜均證明了所研制的樣品是硫酸氨基葡萄糖。

4 均勻性檢驗

標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性是指特性量值在空間分布的均勻程度，它是對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品總體空間分布的評價，是標(biāo)準(zhǔn)樣品的重要質(zhì)量指標(biāo)之一。將同一批制備的硫酸氨基葡萄糖樣品進行分裝，每瓶標(biāo)準(zhǔn)樣品凈重為200 mg，共分裝200瓶。按照GB／T 15000.3–2008［5］規(guī)定，確定抽樣數(shù)目為15個，采用單因素多水平試驗方差分析法對硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進行均勻性檢驗，測定方法為高效液相色譜–蒸發(fā)光散射法，每個樣品重復(fù)測定3次。檢測數(shù)據(jù)用方差分析法進行分析以判斷標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性是否合格。在進行分裝后，對硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品進行純度均勻性檢驗，檢驗數(shù)據(jù)與方差分析結(jié)果分別見表3、表4。

表3 硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品純度均勻性檢驗結(jié)果 %

表4 方差分析結(jié)果

查 表 得F（0.05，14，30）=2.04，F(xiàn)=MS組間／MS組內(nèi)=1.20，F(xiàn)

5 穩(wěn)定性檢驗

為了考察樣品的穩(wěn)定性，確定樣品有效期，取本標(biāo)準(zhǔn)樣品模擬上市包裝，進行25℃條件下的12個月長期試驗，分別于0，1，2，3，6，9，12個月取樣，按穩(wěn)定性重點考察項目檢測，結(jié)果見表5。

表5 硫酸氨基葡萄糖樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果（25℃儲存）

根據(jù)GB／T 15000–2008 《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3） 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》的要求，采用直線模型作為經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，對長期穩(wěn)定性獲得的數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)樣品穩(wěn)定性良好。

長期試驗穩(wěn)定性的不確定度貢獻度ults=sbt=0.07%，穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，硫酸氨基葡萄糖在常溫下保存1年仍然穩(wěn)定。

6 定值分析

6.1 定值方法

標(biāo)準(zhǔn)樣品定值通常采用技術(shù)有效并經(jīng)過嚴(yán)謹(jǐn)認證的方法來完成。目前，硫酸氨基葡萄糖的含量一般利用檢測其中氨基葡萄糖的含量來確定，常用檢測方法有高效液相色譜–蒸發(fā)光散射法［6–7］、高效液相色譜–示差法［8–9］、高效液相色譜–紫外法［10–12］及液質(zhì)聯(lián)用法［13–14］，尚無統(tǒng)一的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。筆者參考文獻采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射法進行定值。

6.2 色譜條件

色譜柱：Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流 動 相：乙 腈–水（體 積 比 為70∶30），流量為0.8 mL／min；柱溫：28℃；蒸發(fā)光散射；漂移管溫度：80℃；氣體壓力：275.8 kPa；進樣體積：10 μL。

7 定值結(jié)果及其不確定度

7.1 定值結(jié)果

按照GB／T 15000.3–2008標(biāo)準(zhǔn)要求，選擇獲得國家或部門認可、具備資質(zhì)的8家實驗室對本標(biāo)準(zhǔn)樣品進行定值。隨機抽取8瓶樣品，每個定值實驗室送樣1瓶，各實驗室均采用高效液相色譜–蒸發(fā)光散射法進行測定，應(yīng)用色譜峰面積歸一法進行定值，定值結(jié)果見表6。

表6 定值結(jié)果匯總表 %

匯集各家實驗室的檢測數(shù)據(jù)后，對每家實驗室的數(shù)據(jù)按大小順序排列，用Grubb’s法和峰度法正態(tài)性檢驗組內(nèi)數(shù)據(jù)，沒有異常值，所有數(shù)據(jù)進行下一步統(tǒng)計，再用Grubb’s法對每家實驗室所得結(jié)果的平均值進行檢驗，將其看成一組測定值進行異常值檢驗，結(jié)果表明無異常值。因此將各家實驗室測得的數(shù)據(jù)作為無偏估計值，計算8家測定結(jié)果的平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差。然后對各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差s進行Cochran檢驗，按照式(1)計算統(tǒng)計量C：

式中：smax——si中的最大值；

si——各實驗室測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

查 表 知C8，6(0.05)=0.362，計 算 得C=0.362，C > C8,3(0.05)，表明各實驗室間的測量不屬于等精度測量，計算加權(quán)平均值為99.84%，作為硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果。

7.2 定值結(jié)果的不確定度

根據(jù)GB／T 15000.3–2008規(guī)定，定值結(jié)果由標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度組成。標(biāo)準(zhǔn)樣品特性標(biāo)準(zhǔn)值的測量不確定度UCRM由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗的不確定度U(x)、均勻性檢驗的不確定度Ubb和穩(wěn)定性檢驗的不確定度Ults組成。依據(jù)全部測定結(jié)果，計算硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性標(biāo)準(zhǔn)值和不確定度。各不確定度分量見表7。

表7 標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)值不確定度分量

標(biāo)準(zhǔn)值的合成不確定度按照式(2)計算：

將表7中數(shù)據(jù)代入式(2)得u=0.09%，擴展不確定度U95=ku=0.18%（k=2）。

經(jīng)過上述統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)處理，硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值定值結(jié)果為99.84%，置信度為95%的擴展不確定度為0.18%（k=2）。

8 結(jié)語

所研制的硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)過均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品符合標(biāo)準(zhǔn)樣品制備要求，特性值定值結(jié)果為99.84%，擴展不確定度為0.18%（k=2）。該標(biāo)準(zhǔn)樣品已通過全國標(biāo)準(zhǔn)樣品技術(shù)委員會的評審。硫酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)樣品為食品安全、環(huán)境監(jiān)測、衛(wèi)生檢驗檢疫等方面的測量和科學(xué)研究提供了技術(shù)支撐和量值溯源保證。

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［5］GB／T 15000.3–2008 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3） 標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法［S］.

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