梁春輝，張寒，李雪寧

(1.西安市兒童醫(yī)院，陜西 西安 710003;2.西安醫(yī)學院 藥學院，陜西 西安 710021;3.興平408 醫(yī)院，陜西 咸陽 713100)

青莢葉［Helwingia japonica(Thunb)］為山茱萸科青莢葉屬植物，又名葉上花、葉上果，全株入藥，其根味辛、微甘、性平，能驅(qū)風除濕、祛瘀活血?？芍挝竿?、痢疾、便血、子宮脫出等病癥。其葉入藥，可治小兒高燒，外用治燒燙傷，毒咬傷，也有清熱解毒，消腫止痛的功效。其干燥莖髓入藥，藥名小通草，具有清熱利尿、下乳等作用。國內(nèi)外有關(guān)青莢葉的研究較少。有文獻報道關(guān)于青莢葉的化學成分有:谷甾醇、β-胡蘿卜苷、羽扇豆醇、樺木醇、樺木酸、棕櫚酸甘油酯、桂皮酸、木犀草素7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷［1］、表兒茶素［2］、肉桂酸、α-香樹脂醇、木犀草素7-O-β-D-葡萄糖苷［3］、4'-羥基-7-O-葡萄糖-2，3-二羥黃酮甙、黃豆甙、5-葡萄糖芹菜甙、7-O-葡萄糖芹菜甙、4-O-葡萄糖香豆酸、葡萄糖咖啡酸［4］等。國內(nèi)外現(xiàn)有文獻記載中未見青莢葉中肉桂酸和木犀草素的含量測定，因此本文采用HPLC 法對青莢葉中肉桂酸和木犀草素含量進行測定。在選定的色譜條件下，供試溶液中肉桂酸和木犀草素與相鄰組分分離度良好。經(jīng)方法學考察，方法的重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率均符合有關(guān)規(guī)定，可用于該藥材的質(zhì)量控制。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

木犀草素對照品(上海金穗生物科技有限公司，JS90108-20 mg);肉桂酸對照品，西安醫(yī)學院化學合成室制;甲醇，色譜純;磷酸、乙醚、甲酸均為分析純;青莢葉采自秦嶺太白山。

Agilent 高效液相色譜儀;KQ-300B 型超聲波清洗器;GR-202 型分析天平。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為室溫，進樣量20 μL。木犀草素:流動相為甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，檢測波長350 nm;流速1.0 mL/min;肉桂酸:流動相為甲醇-1. 67% 冰醋酸水溶液(50 ∶50)，檢測波長270 nm，流速1 mL/min，在以上色譜條件下，理論塔板數(shù)為2 000 以上，木犀草素和肉桂酸峰的分離度均符合要求。

1.2.2 對照品溶液的配制

1.2.2.1 木犀草素對照品溶液的配制 精密稱定木犀草素對照品3.4 mg，置10 mL 容量瓶中用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.34 mg 的木犀草素對照品溶液。

1.2.2.2 肉桂酸對照品溶液的配制 精密稱定肉桂酸對照品6.0 mg，置10 mL 容量瓶中用甲醇溶解并定容，制成每1 mL 含0.6 mg 的肉桂酸對照品溶液。

1.2.3 供試品溶液的配制

1.2.3.1 木犀草素供試品溶液的配制 稱取青莢葉藥材5 g(3 份)，置250 mL 帶塞錐形瓶中，加150 mL甲醇浸泡140 min，再超聲提取1.5 h，抽濾，取濾液，殘渣再加100 mL 甲醇超聲提取1 h，抽濾，取濾液，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加50 mL 水溶解，用乙醚萃取3 次(每次加乙醚30 mL)萃取液水浴蒸干，甲醇溶解，移至25 mL 容量瓶，甲醇定容，得供試品溶液。

1.2.3.2 肉桂酸供試品溶液的配制 稱取青莢葉藥材5 g(3 份)，置150 mL 索氏提取器中，加入100 mL甲醇∶甲酸(95∶5)，浸泡18 h，然后用加熱回流提取2 次，第1 次提取2 h，第2 次提取1 h，合并兩次提取液，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，甲醇定容，得供試品溶液。

1.2.4 測定方法 分別取對照品溶液和供試品溶液5 mL，用0.45 μm 有機微孔濾膜過濾至微量離心管中，精密吸取20 μL，注入高效液相色譜儀，按

1.2.1節(jié)色譜條件測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素測定

分別吸取微量離心管中對照品溶液，供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按1.2.1 節(jié)色譜條件測定，結(jié)果見圖1、圖2。由圖1、圖2 可知，在供試品中木犀草素與對照品色譜峰保留時間一致，達到基線分離。

圖1 木犀草素對照品液相色譜圖Fig.1 Luteolin control liquid chromatogram

圖2 青莢葉供試品液相色譜圖Fig.2 Helwingia sample liquid chromatogram

2.2 肉桂酸測定

分別吸取微量離心管中對照品溶液，供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按1.2.1 節(jié)色譜條件測定，結(jié)果見圖3、圖4。由圖3、圖4 可知，在供試品中肉桂酸與對照品色譜峰保留時間一致，達到基線分離。

圖3 肉桂酸對照品液相色譜圖Fig.3 Cinnamic acid standard HPLC chromatogram

圖4 青莢葉供試品液相色譜圖Fig.4 Helwingia sample liquid chromatogram

2.3 線性關(guān)系的考察

2.3.1 木犀草素線性關(guān)系 精密量取1.2.2.1 節(jié)對照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 至5 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)分別繪制標準曲線，得木犀草素回歸方程為Y = 12 637X +11.479，R2=0.999 9(n =5)。結(jié)果表明，木犀草素進樣量在0.003 4 ～0.054 4 mg 線性關(guān)系良好。

2.3.2 肉桂酸線性關(guān)系 精密量取1.2.2.2 節(jié)對照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.0 mL 至5 mL 容量瓶中，用甲醇溶液定容至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進樣20 μL，測定。以對照品進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積積分值為縱坐標(Y)分別繪制標準曲線，得肉桂酸回歸方程為Y =1.5E +5X－509.10，R2=0.999 4(n =5)。結(jié)果表明，肉桂酸進樣量在0.000 24 ～0.002 4 mg 線性關(guān)系良好。

2.4 重復(fù)性實驗

精密量取1.2.2 節(jié)木犀草素、肉桂酸及對照品溶液各6 份(20 μL)，分別進樣，測定峰面積。結(jié)果木犀草素的RSD = 0. 034 9%，肉桂酸的RSD =1.98%。表明本實驗重復(fù)性良好。

2.5 穩(wěn)定性實驗

精密量取1.2.2 節(jié)木犀草素和肉桂酸對照品溶液，分別在0，2，4，8，12，24 h 各進樣20 μL，分別測定它們的峰面積。結(jié)果木犀草素和肉桂酸的RSD 分別為0.058 7%和1.49%。表明二者在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收率實驗

2.6.1 木犀草素 取木犀草素供試液6 份，精密量取500 μL，分別加入對照品溶液100 μL，混勻，即得。分別進樣20 μL 測定，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為99.67%，RSD 為0.26%。

2.6.2 肉桂酸 取肉桂酸供試液6 份，精密量取1 000 μL，分別加入對照品溶液200 μL，混勻，即得。分別進樣20 μL 測定，計算加樣回收率。平均回收率為93.64%，RSD 為1.45%。

2.7 樣品測定

取1.2.3 節(jié)的供試品溶液，用0.45 μL 微孔濾膜過濾至微量離心管中，取20 μL 在1.2.1 節(jié)色譜條件下分別進樣測定，計算各個成分含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果Table 1 Samples for the determination of results

3 結(jié)論

(1)有相關(guān)文獻記載［5-6］，木犀草素的檢測波長有269，283，350 nm，實驗中發(fā)現(xiàn)在350 nm 處木犀草素的峰型和峰面積均十分理想，故本實驗采用350 nm 對木犀草素進行檢測;肉桂酸的檢測波長有270，280 nm，實驗中發(fā)現(xiàn)在270 nm［7-8］處肉桂酸的峰型和峰面積均十分理想，故本實驗采用270 nm 對肉桂酸進行檢測。

(2)采用高效液相色譜法測定青莢葉藥材中總黃酮(以木犀草素為指標)、肉桂酸的含量。該法靈敏、簡單易行，專屬性、重復(fù)性、回收率均符合要求。實驗結(jié)果表明，在青莢葉中，木犀草素的含量太低，實際檢測意義不大。而肉桂酸的含量較高，可以考慮用檢測肉桂酸的含量來作為控制青莢葉的質(zhì)量指標成分之一。

［1］ Xia Lizi，Zhou Min，Xiao Yanhua，et al.Chemical constituents from Helwingiajaponica［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8(1):16-20.

［2］ 劉利娥，李紅萍，吳予明，等. 反相高效液相色譜法測定青莢葉中表兒茶素含量［J］. 鄭州大學學報:醫(yī)學版，2010，45(1):132-134.

［3］ 楊娟，婁方明，牛煜坤.中華青莢葉化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2007，32(14):1416-1418.

［4］ 來國防，趙沛基，倪志偉，等. 中華青莢葉的一個新果糖酯［J］.云南植物研究，2008，30(1):115-120.

［5］ 高勇，馬東升，鄧立育.木犀草素的高效液相色譜分析［J］.檢驗檢疫學，2004，14(5):24-25.

［6］ 王柯，王艷艷，趙東保，等.HPLC 法測定金銀花不同部位中木犀草素及其苷的含量［J］.河南大學學報:自然科學版，2001，41(1):39-43.

［7］ 郝福，張福成，蔣曄，等. 反相高效液相色譜法測定蘇合香丸中肉桂酸的含量［J］. 中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學，2007，24(2):147-149.

［8］ 張洪娟，張妍妍，隋軍，等. 不同產(chǎn)地獨角蓮藥材中肉桂酸的含量測定［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2009，20(5):1143-1144.