邢建宇，白波，李宇亮，宋秀玲

(長(zhǎng)安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054)

膠原蛋白是生物體主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在體外，當(dāng)溶液環(huán)境變化時(shí)，可溶性膠原蛋白可發(fā)生自組裝聚集作用，進(jìn)而成纖維化形成膠原纖維。該功能使得膠原蛋白被廣泛的應(yīng)用于化工、醫(yī)藥材料、食品、飼料等領(lǐng)域。天然的膠原蛋白聚集需要的條件，大概為pH 5.0 ～8.5，離子強(qiáng)度在0.1 ～0.8，溫度在15 ～37 ℃［1］。以后的研究表明，pH、溫度、離子強(qiáng)度、離子類型、表面活性劑、糖類以及膠原蛋白非螺旋末端的去除，都對(duì)膠原纖維的形成有影響。

功能性材料的研制及其相關(guān)機(jī)理研究一直都是化學(xué)化工專業(yè)的熱門領(lǐng)域，但是純化學(xué)合成的材料不利于細(xì)胞的吸附，缺乏內(nèi)源性信號(hào)。生物材料在合成中應(yīng)用可以有效的模擬生物環(huán)境，但是其位點(diǎn)選擇性修飾比化學(xué)方法要復(fù)雜，而且機(jī)械強(qiáng)度差。將化學(xué)合成材料與生物質(zhì)材料相結(jié)合，可兼容有機(jī)化合物分子和生物分子的優(yōu)點(diǎn)，在應(yīng)用上更有潛力且應(yīng)用面更廣［2］。在化學(xué)合成材料與生物質(zhì)材料相結(jié)合過程中，無(wú)機(jī)離子及有機(jī)分子與膠原蛋白的相互作用無(wú)疑起著非常關(guān)鍵的基礎(chǔ)作用，對(duì)于不同金屬離子對(duì)于膠原蛋白的影響，不僅可以在結(jié)構(gòu)上闡述兩者相互作用的方式及機(jī)理，研制出更多類型的功能性新材料，如人工骨的合成［3］、微囊材料的研制［4］等。在應(yīng)用上還會(huì)為以膠原蛋白為原料的吸附材料的廣泛應(yīng)用提供參考，如污染水質(zhì)中重金屬的去除［5］、以金屬離子為介導(dǎo)的吸附材料的應(yīng)用［6］等。本文使用不同濃度金屬離子對(duì)膠原蛋白的自聚集過程進(jìn)行了研究，并考察了金屬離子存在時(shí)pH 對(duì)該過程的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

牛筋，購(gòu) 自 西 安 市;CuSO4、ZnSO4、K2SO4、Fe2(SO4)3、胃蛋白酶均為分析純。

752 型紫外可見分光光度計(jì);XS-212-201 型生物顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

解凍的牛筋沖洗干凈后，用剪刀剪成小塊，放入體積為牛筋20 倍的0.1 mol/L NaOH 溶液中。在恒溫?cái)嚢杵飨聰嚢? h 以除去膠原蛋白中的非膠原成分。用清水沖洗牛筋至中性。再將牛筋放入體積為牛筋3 倍的0. 5 mol/L 的醋酸溶液中，以質(zhì)量比1∶100加入胃蛋白酶，靜置后過濾得膠原蛋白溶液備用。

取膠原蛋白溶液20 mL，用濃度為0.5 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至5。分裝到4 支試管中。并分別向試管中加入0.5，1.5，2.5 mmol/L 的金屬離子。每隔15 min 用紫外分光光度計(jì)測(cè)溶液的吸光值。每組實(shí)驗(yàn)做3 次，取平均值。取膠原蛋白溶液15 mL，分別以每試管5 mL 的量加入3 支試管，調(diào)節(jié)其pH 分別為3. 0，5. 0，7. 0，再向每支試管加入1.5 mmol/L的金屬離子溶液。每隔15 min 用紫外分光光度計(jì)測(cè)溶液的吸光值。每組實(shí)驗(yàn)做3 次，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 金屬離子與膠原蛋白的相互作用

在不同的pH 下，金屬離子與膠原蛋白的相互作用可能會(huì)引起不同的聚集狀態(tài)。由于金屬離子的溶解性受pH 影響，所以在特定的pH 條件下，金屬離子溶解性會(huì)降低并析出。而膠原蛋白在pH 升高的過程中，也會(huì)發(fā)生自聚集作用，形成膠原纖維。所以研究不同金屬離子與膠原蛋白的相互作用時(shí)，在pH 影響下的析出過程，會(huì)有以金屬離子引起膠原變性產(chǎn)生的沉淀以及金屬離子輔助膠原蛋白自聚集產(chǎn)生纖維兩種情況。膠原蛋白聚集體示意圖，見圖1。

圖1 膠原蛋白聚集體示意圖Fig.1 Picture of collagen aggregates

圖1A 中，不含有金屬離子的膠原蛋白溶液在合適的pH 環(huán)境條件下，不需添加任何試劑，可自發(fā)進(jìn)行側(cè)鏈的相互作用，進(jìn)而形成膠原纖維。圖1B，不同的金屬離子可在不同程度上加快或者抑制這一過程。但是所產(chǎn)生的聚集體主要還是以纖維狀為主。圖1C 當(dāng)金屬離子含量較高時(shí)，pH 引起金屬離子溶解性的變化，此時(shí)膠原蛋白容易發(fā)生變性，形成無(wú)規(guī)則的卷曲，所形成的沉淀聚集，并非以纖維狀存在，而是以粒狀沉淀為主。

2.2 不同金屬離子對(duì)膠原蛋白自聚集過程的影響

膠原蛋白在酸性條件下可溶，其自聚集過程的發(fā)生，隨著pH 的升高，而速率加快。為了考察金屬離子對(duì)于這種自聚集析出過程的影響，特選擇pH 5.0作為考察金屬離子影響的最適pH，膠原蛋白濃度選擇1 mg/mL。由于不同陰離子對(duì)于膠原蛋白的自聚集作用也有著顯著的影響［7］，故所選擇的陰離子均為硫酸鹽，在同樣的陰離子存在狀態(tài)下，對(duì)不同的金屬離子的影響進(jìn)行考察。

Cu2+對(duì)膠原蛋白自聚集過程的影響見圖2A。當(dāng)不存在Cu2+時(shí)，膠原蛋白會(huì)發(fā)生緩慢的自聚集作用，而隨著Cu2+的加入，自聚集作用迅速提高，且隨著Cu2+的增加，自聚集的速度也更快。但是當(dāng)Cu2+為2.5 mmol/L 時(shí)，膠原蛋白溶液的濁度先增加后減小?？赡苁且?yàn)镃u2+與膠原蛋白側(cè)鏈的相互作用是以螯合形式發(fā)生的，該種螯合作用有利于側(cè)鏈之間的聚集，而當(dāng)金屬離子含量增高時(shí)，金屬離子正電荷之間的互相排斥，而不利于膠原蛋白的聚集。由圖2B 和表1 可知，Zn2+對(duì)于膠原蛋白自聚集過程的影響比較小，不含Zn2+時(shí)，斜率約為0. 15 ×10－3，隨著Zn2+的添加，斜率略有升高，變?yōu)?.25 ×10－3。當(dāng)Zn2+濃度為1. 5 mmol/L 時(shí)，斜率降為0.13 ×10－3。當(dāng)Zn2+濃度為2.5 mmol/L 時(shí)，斜率降為0.1 ×10－3。說明在0 ～2.5 mmol/L 的濃度范圍內(nèi)，Zn2+在低濃度時(shí)有助于膠原蛋白的自聚集，但是隨著濃度的升高，而出現(xiàn)抑制作用。由表1 可知，當(dāng)硫酸鐵的含量為0，0.5，1.5，2.5 mmol/L 時(shí)，所對(duì)應(yīng)的膠原自聚集曲線的斜率分別為0. 16 ×10－3，1.27 ×10－3，2.2 ×10－3，3.24 ×10－3。在0 ～2.5 mmol/L 的濃度范圍內(nèi)，呈依次增大的趨勢(shì)且并沒有出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象。K+的加入會(huì)引起膠原蛋白自聚集速率的降低。由圖2D 及表1 可知，在0 ～2.5 mmol/L的濃度范圍，K+的存在增加了膠原蛋白分子表面的電荷，增強(qiáng)了其與水分子的相互作用，使膠原蛋白的溶解性增大。

圖2 pH 5.0 時(shí)不同金屬離子對(duì)膠原蛋白自聚集過程的影響Fig.2 Effect of different metal ions on self-aggregation processes of collagen with pH 5.0

表1 不同金屬離子對(duì)于膠原自聚集產(chǎn)生的濁度變化速率的影響Table 1 Effect of different metal ions on turbidity change rate produced by collagen self aggregation

根據(jù)柯林斯理論［8］，將離子都近似看作為中心處帶有一個(gè)點(diǎn)電荷的殼球，當(dāng)離子半徑較小時(shí)，周圍的水合離子就會(huì)與之緊密結(jié)合;反之，當(dāng)離子半徑較大時(shí)，周圍的水合離子與它的結(jié)合作用就較弱。Cu2+、Zn2+、Fe3+、K+的離子半徑分別為0. 073，0.074，0.055，0.138 nm。其中K+的離子半徑大于其他3 個(gè)離子，所以K+與膠原分子的相互作用力弱于其他3 個(gè)離子。而離子半徑最小的Fe3+由于能與周圍水合離子緊密結(jié)合，所以比Zn2+具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，在引起膠原蛋白自聚集時(shí)作用更加明顯。Cu2+和Zn2+具有相同的離子半徑，但是Cu2+具有更強(qiáng)的促膠原自聚集作用。這可能與Cu2+在溶液中的存在狀態(tài)有關(guān)，Cu2+在水溶液中實(shí)際上是以水合離子［Cu(H2O)4］2+的形式存在的，該種水合狀態(tài)更加有利于Cu2+吸附到膠原蛋白表面。所以Cu2+在金屬離子中與膠原蛋白的結(jié)合能力最強(qiáng)，很多膠原蛋白吸附材料的制備都表現(xiàn)出對(duì)Cu2+強(qiáng)的吸附能力。

2.3 不同金屬離子存在的條件下pH 對(duì)膠原自聚集過程的影響

使用濃度較低的膠原蛋白溶液(0.3 mg/mL)，分別選取了pH 3.0，5.0，7.0 作為測(cè)試Cu2+、Zn2+、Fe3+的pH 條件，根據(jù)不同濃度金屬離子對(duì)膠原蛋白聚集過程的影響，Cu2+、Zn2+、Fe3+的濃度分別選擇為1.5，2.5，1.5 mmol/L，結(jié)果見圖3。

圖3 不同pH 下Cu2+、Zn2+、Fe3+對(duì)膠原蛋白聚集過程的影響Fig.3 Effect of Cu2+，Zn2+ and Fe3+ on collagen aggregation process with different pH

由于常溫下Cu2+可在pH 5.2 ～6.4 形成沉淀。所以由圖3A 可知，不同的pH 條件對(duì)于Cu2+促膠原蛋白共聚集的影響并不是很大，Cu2+在pH 為5.0時(shí)，對(duì)膠原共聚集作用影響最大。相對(duì)于Cu2+而言，Zn2+在pH 7.0 左右會(huì)形成沉淀，所以Zn2+的溶解性有著更加寬泛的pH 范圍。由圖3B 可知，pH的改變對(duì)于Zn2+促膠原蛋白聚集過程的影響較大，pH 為3.0 時(shí)，膠原蛋白的聚集作用并不明顯，當(dāng)pH為5.0 時(shí)，在45 ～60 min 有較大的濁度變化，預(yù)示著聚集作用的發(fā)生。當(dāng)pH 為7.0 時(shí)，膠原蛋白的聚集作用發(fā)生的時(shí)間被縮短，在30 min 時(shí)濁度達(dá)到平衡。Fe3+存在的條件下，不同pH 對(duì)于膠原蛋白自聚集作用的影響見圖3C。當(dāng)pH 為3.0 和5.0時(shí)，膠原蛋白溶液的濁度變化并不大，但是當(dāng)pH 為7.0 時(shí)，濁度發(fā)生很大的改變，此時(shí)膠原蛋白的聚集，可能不再是金屬離子輔助的膠原蛋白有規(guī)律的成纖維狀態(tài)，而是以Fe3+析出為主的相變過程，在此過程中膠原蛋白以無(wú)規(guī)則狀態(tài)伴隨著Fe3+的析出而析出。由以上不同的金屬離子的分析可知，因?yàn)閜H 對(duì)于金屬離子的存在狀態(tài)以及對(duì)于膠原蛋白的自聚集作用都有較大的影響，且不同金屬離子的溶解性具有不同的pH 范圍。所以不同的金屬離子在膠原自聚集過程中的影響更加復(fù)雜。

3 結(jié)論

考察了不同的金屬離子對(duì)于膠原蛋白自聚集過程的影響，在與膠原蛋白的相互作用方面，基本符合柯林斯理論，大小順序?yàn)镃u2+＞Fe3+＞Zn2+＞K+。另外，對(duì)于金屬離子存在條件下，pH 對(duì)于膠原蛋白自聚集的影響研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+存在時(shí)，pH 的影響并不大，而Zn2+存在時(shí)影響較大。Fe3+在輔助膠原成纖維方面影響不大，且溶解性受pH 影響更大。

［1］ Li Y P，Asadi A，Monroe M R，et al.pH effects on collagen fibrillogenesis in vitro:Electrostatic interactions and phosphate binding［J］. Materials Science and Engineering:C，2009，29(5):1643-1649.

［2］ 賀金梅，葉真銘，程瑋璐，等. 膠原蛋白的功能化改性研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代化工，2013，33(6):28-31.

［3］ Jia M F，Hong Y P，Duan S Y，et al.The influence of transition metal ions on collagen mineralization［J］.Materials Science and Engineering:C，2013，33(4):2399-2406.

［4］ Przybyla D E，Rubert Pérez C M，Gleaton J，et al.Hierarchical assembly of collagen peptide triple helices into curved disks and metal ion-promoted hollow spheres［J］.Journal of the American Chemical Society，2013，135(9):3418-3422.

［5］ Pourjavadi A，Salimi H，Amini-Fazl M S，et al. Optimization of synthetic conditions of a novel collagen-based superabsorbent hydrogel by Taguchi method and investigation of its metal ions adsorption［J］. Journal of Applied Polymer Science，2006，102(5):4878-4885.

［6］ 鄧慧，廖學(xué)品. 膠原纖維負(fù)載鋯對(duì)氟離子和磷酸根的吸附去除［J］.精細(xì)化工，2013，30(1):80-84.

［7］ Collins K D. Ions from the Hofmeister series and osmolytes:effects on proteins in solution and in the crystallization process［J］.Methods，2004，34(3):300-311.

［8］ Collins K D，Neilson G W，Enderby J E. Ions in water:Characterizing the forces that control chemical processes and biological structure［J］.Biophysical Chemistry，2007，128(2/3):95-104.