許小英，李夢(mèng)耀，馬嵐，張敏，同祿祿

(1.長(zhǎng)安大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710054;2.旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(長(zhǎng)安大學(xué))，陜西 西安 710054)

黃酮類(lèi)化合物具有擴(kuò)張血管、抑制血小板活化因子、抗氧化、調(diào)血脂和抗腫瘤等藥理作用［1-2］。近年來(lái)，銀杏葉黃酮的提取和測(cè)定方法研究十分活躍［3］。銀杏黃酮的測(cè)定方法主要有紫外分光光度法［4］、熒光光度法［5］、高效液相色譜法［6］、薄層掃描法［7］、毛細(xì)管電泳法等［8］。本文依據(jù)銀杏黃酮的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，建立并采用溴量法對(duì)黃酮類(lèi)化合物的含量進(jìn)行測(cè)定，該方法具有較高的準(zhǔn)確度和精確度，操作方法簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)，適合于測(cè)定天然產(chǎn)物提取液中黃酮的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

黃酮標(biāo)準(zhǔn)(蘆丁)、溴酸鉀、溴化鉀、碘化鉀、硫代硫酸鈉等均為分析純;重鉻酸鉀，優(yōu)級(jí)純;蒸餾水;銀杏樹(shù)葉(金黃色，洗凈，陰干)。

AL204 電子天平;101-2AB 電熱鼓風(fēng)干燥箱;THZ-82 恒溫振蕩器。

1.2 黃酮標(biāo)準(zhǔn)液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取黃酮標(biāo)準(zhǔn)品0.664 6 g，加入少量乙醇微熱至完全溶解，轉(zhuǎn)移到200 mL 的容量瓶中，冷卻到室溫后，蒸餾水定容至刻度，即得到5 mmol/L 的黃酮標(biāo)準(zhǔn)貯備液。

1.3 測(cè)定原理

銀杏葉中所含的黃酮類(lèi)化合物主要是黃酮醇苷類(lèi)成分［9-10］，其分子結(jié)構(gòu)含有酚羥基，在一定條件下，可與溴分子發(fā)生親電取代反應(yīng)，只要能夠確定與一分子黃酮起反應(yīng)的溴分子數(shù)，就可用溴量法測(cè)定黃酮的含量。

測(cè)定原理用反應(yīng)方程式表示如下:

Br2的生成 5KBr+KBrO3+6HCl→3Br2+3H2O+6KCl

取代 黃酮 +zBr2→取代產(chǎn)物+zHBr

滴定 Br2(剩余)+ 2KI →I2+ 2KBr

平行進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，確定加入溴的總量，用黃酮標(biāo)準(zhǔn)作為樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算反應(yīng)系數(shù)z。

式中 z——與1 分子黃酮進(jìn)行反應(yīng)的Br2分子數(shù);

1.4 測(cè)定方法

準(zhǔn)確移取黃酮標(biāo)準(zhǔn)液(或銀杏黃酮提取液)10.00 mL 于250 mL 碘量瓶中，加入0.05 mol/L 的溴試劑10.00 mL，微開(kāi)瓶塞，加入6 mol/L 的鹽酸3.00 mL，立即蓋上瓶塞，用少量蒸餾水封口，稍微振蕩，置于暗處30 min。微開(kāi)瓶塞，加入10%的碘化鉀5.0 mL，立即蓋上瓶塞，搖勻放置5 min。加氯仿2 mL，輕輕振蕩，使沉淀溶解。用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，當(dāng)溶液顏色變?yōu)闇\黃色時(shí)，加入2 mL淀粉指示劑，滴定直至溶液藍(lán)色褪去，即為滴定終點(diǎn)。平行進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。按下式計(jì)算銀杏提取液中黃酮的濃度。

式中 cH——樣品溶液中銀杏黃酮的濃度，mg/L;

2 結(jié)果與討論

2.1 黃酮與Br2反應(yīng)系數(shù)的確定

2.1.1 反應(yīng)時(shí)間 保持溶液的酸度不變，加入溴的物質(zhì)量為黃酮的7 倍，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1 可知，反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響不大，但是反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)不完全;而反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，溴又易揮發(fā)，不利于反應(yīng)系數(shù)的測(cè)定，綜合考慮，選擇30 min 作為最佳反應(yīng)時(shí)間。

表1 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響Table 1 The impact of reaction time on reaction coeffient

2.1.2 鹽酸用量 其他因素不變，反應(yīng)時(shí)間為30 min 時(shí)，考察6 mol/L 鹽酸用量對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鹽酸用量對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響Table 2 The impact of HCl amount on reaction coeffient

由表2 可知，鹽酸用量對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響不顯著。但加入鹽酸量較少時(shí)，使溴產(chǎn)生的不完全，影響反應(yīng)系數(shù)的測(cè)定，選擇加入的酸量為3.0 mL。

2.1.3 溴試劑用量 由表3 可知，在保證溴過(guò)量的情況下，溴試劑的量對(duì)反應(yīng)系數(shù)沒(méi)有顯著影響，但溴試劑的加入量也不宜過(guò)多。通常情況下，溴過(guò)量20%即可，取n(Br2)∶n(黃酮)=5∶1。

表3 溴試劑用量對(duì)反應(yīng)系數(shù)的影響Table 3 The impact of bromine reagent amounton reaction coeffient

2.2 樣品分析

準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g 干的銀杏葉于250 mL 圓底燒瓶中，加入60 mL 95%乙醇，在恒溫水浴鍋中，60 ℃下回流90 min，傾倒出濾液。重復(fù)上述步驟3 次，合并4 次提取液，取上清液測(cè)定銀杏黃酮的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4 可知，10 次測(cè)定同一銀杏黃酮提取液，黃酮的平均濃度為1.674 g/L，各次測(cè)定數(shù)值接近，說(shuō)明溴量法測(cè)定銀杏黃酮提取液重現(xiàn)性較好。

表4 銀杏黃酮樣品含量測(cè)定結(jié)果Table 4 The content measurement results of Ginkgo biloba extract sample

2.3 精密度

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精密度分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 銀杏黃酮標(biāo)準(zhǔn)品精密度分析結(jié)果Table 5 The accuracy analysis results of Ginkgo biloba extract standard sample

由表5 可知，對(duì)提取液1 和提取液2，10 次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)偏差都較小，說(shuō)明測(cè)定方法具有良好的可信度。

2.4 準(zhǔn)確度

對(duì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 銀杏黃酮加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 6 The add mark recovery rate measurement results of Ginkgo biloba extract

由表6 可知，溴量法測(cè)定銀杏黃酮提取液的加標(biāo)回收率為97. 6% ～98. 8%，該方法較為準(zhǔn)確，可靠。

3 結(jié)論

(1)依據(jù)黃酮可以和溴分子發(fā)生親電取代反應(yīng)，建立了一種溴量法測(cè)定黃酮的新方法，實(shí)驗(yàn)測(cè)得1 分子黃酮與5 分子溴反應(yīng)親電取代反應(yīng)，溴與黃酮反應(yīng)系數(shù)比為5∶1。

(2)溴量法測(cè)定1.674 g/L 銀杏黃酮提取液，10次測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.48 ×10－5，加標(biāo)回收率為97.6%，98.8%，方法準(zhǔn)確、可靠，適用于天然植物提取液中黃酮的測(cè)定。

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