朱 群，王二柱，常 娟，尹清強(河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南鄭州450002)

抗生素對特異性的微生物具有抑制或殺滅作用［1］，作為一種抗菌消炎藥，在過去的幾十年內(nèi)在治療和預防動物疾病上給人們帶來了很多的益處，但同時也帶來許多負面影響。因為它在殺死致病菌的同時，對有益菌也有一定的殺滅作用，隨著抗藥和耐藥菌及“超級病菌”的出現(xiàn)，人們加大了抗生素的用量，導致藥物殘留等畜產(chǎn)品安全問題日益嚴重，給人們的健康帶來了不良影響，尋找抗生素替代品成為當今研究的熱點問題。

益生菌是一種活菌制劑，其本身及其代謝產(chǎn)物對動物機體能夠發(fā)揮有益的作用［2］，作為一種新的飼料添加劑逐漸為人們所熟知。益生菌能夠在數(shù)量上和種類上補充腸道內(nèi)缺乏的微生物菌群，當其在動物腸道內(nèi)達到一定數(shù)量時能調整并維持腸道內(nèi)正常的微生態(tài)平衡，抑制有害微生物的生長［3］，益生菌的體外抑菌試驗可以采用牛津杯法測定［4］。益生菌的抑菌能力歸因于其種群優(yōu)勢、競爭性抑制及其代謝產(chǎn)物(如乳酸等)。有些益生菌(如芽孢桿菌)雖然不能在動物體內(nèi)長期定植，但是當其經(jīng)過腸道時利用種群優(yōu)勢發(fā)揮生物奪氧的功能，從而抑制其他需氧菌的生長，同時還能產(chǎn)生多種維生素等營養(yǎng)物質供動物體吸收利用［5］?；谝嫔莫毺貎?yōu)勢，它逐漸在動物生產(chǎn)中得以廣泛應用［6－7］。

金霉素(Chlortetracycline)，又名氯四環(huán)素，屬于廣譜抗生素，許多立克次體屬、支原體屬、衣原體屬、非典型分枝桿菌屬、螺旋體對金霉素敏感。隨著人們對畜產(chǎn)品安全生產(chǎn)重視度的不斷提高，抗生素的禁止和限制使用越來越普遍。盡管抗生素對致病菌和益生菌都具有殺滅作用，但有研究表明抗生素與益生菌的聯(lián)合使用也能達到很好的效果［8－9］。為了探討金霉素和益生菌聯(lián)合抑制致病菌生長的效果，使金霉素在低劑量的情況下發(fā)揮最大的抑菌和促生產(chǎn)作用，筆者選用乳酪桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母4種益生菌和金霉素配比研究其對致病菌性大腸桿菌的抑制作用，探討金霉素與微生態(tài)制劑的最佳配伍比例，為益生菌和抗生素的配伍使用提供理論依據(jù)，以期獲得一種新型的飼料添加劑或高效的治療動物消化道疾病的復合藥物制劑。

1 材料與方法

1.1 金霉素與微生物 金霉素由河南駐馬店華中正大有限公司提供，其標準溶液的配制為:樣品置于干燥器中干燥12 h后，準確稱取3 g樣品(精確到0.000 2 g)加0.1 mol/L鹽酸30 ml攪拌5 h后定容至50 ml，在無菌條件下用0.2 μm濾膜過濾，配置成9 000 U/ml的無菌金霉素溶液，然后通過不同梯度的稀釋，制備金霉素含量分別為75、150、200、300、400、500和600 mg/L的標準溶液。益生菌:枯草芽孢桿菌、布拉迪酵母、乳酪桿菌、糞腸球菌和大腸桿菌均由河南農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)與生物技術實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 培養(yǎng)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的LB培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、用蒸餾水定容至1 L，pH 為7.0 ～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌 20 min。接種大腸桿菌后，37℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 大腸桿菌鑒別培養(yǎng)基－伊紅美藍培養(yǎng)基。蛋白胨10 g、乳糖 10 g、磷酸氫二鉀 2 g、瓊脂 14 g、伊紅 0.4 g、美蘭0.065 g，定容至1 L，pH 為7.2 ±0.4，在 0.15 MPa 高壓下蒸汽滅菌20 min。平皿接種微生物后在37℃培養(yǎng)48 h，然后記錄大腸桿菌的菌落數(shù)(具有金屬光澤的菌落)，以對數(shù)(lg)形式表示。

1.2.3 培養(yǎng)乳酸桿菌和糞腸球菌的MRS培養(yǎng)基。胰蛋白胨10 g、牛肉蛋白胨10 g、酵母浸出物5 g、葡萄糖20 g、吐溫(80)1 ml、磷酸氫二鉀2 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸鈉 2 g、硫酸鎂200 mg、硫酸錳50 mg，用蒸餾水定容至1 L，pH 為6.2 ～6.6，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種乳酸桿菌后，37℃下靜止培養(yǎng)48 h。

1.2.4 培養(yǎng)酵母菌的YPD培養(yǎng)基。酵母浸提物10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g，用蒸餾水定容至1 L，pH 為7.0 ～7.2，在0.15 MPa高壓下蒸汽滅菌20 min。接種酵母菌后，30℃下振蕩(150 r/min)培養(yǎng)48 h。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合益生菌對大腸桿菌的抑菌作用。按照4因素4水平的正交試驗設計，先將單獨益生菌培養(yǎng)液用培養(yǎng)基稀釋至活菌數(shù)為1×108個/ml，然后按4因素4水平表配制成復合益生菌制劑。將大腸桿菌的培養(yǎng)液均勻的涂布在已加入固體培養(yǎng)基的平皿中，待其完全吸收后放入牛津杯，向牛津杯中加入100 μl復合益生菌菌液，每個處理3個重復，放于4℃條件下吸收4 h，然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。

1.3.2 復合益生菌與金霉素配伍對大腸桿菌的抑菌效果。按照“1.3.1”選出的復合益生菌最優(yōu)組合，加入一定量的金霉素，配制成含不同金霉素濃度的復合益生菌制劑。另外，以不同濃度的單一金霉素作為對照組，按照“1.3.1”中方法測定抑菌圈大小。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，使用SAS 6.12統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對大腸桿菌生長的抑制作用 從表1可以看出，復合益生菌抑制大腸桿菌的最佳組合為枯草芽孢桿菌∶酵母菌∶乳酪桿菌∶糞腸球菌 =2∶1∶3∶4(P ＜0.05)。

2.2 復合益生菌與金霉素配伍對大腸桿菌生長的抑制作用 由表2可知，隨著金霉素濃度的提高，無論是單一的金霉素還是其與益生菌的復合物，其抑菌作用逐漸增強(P＜0.05)。單獨復合益生菌對大腸桿菌的抑制作用與75～150 mg/L的金霉素相當。當150 mg/L金霉素與益生菌配合后，其抑菌效果與單獨300～400 mg/L金霉素作用相當;而當400 mg/L金霉素與益生菌配合后，其抑菌效果要優(yōu)于單獨600 mg/L金霉素的作用。由此可知，低濃度金霉素與復合益生菌配合后，可以達到高濃度金霉素的抑菌效果。

3 討論與結論

3.1 單獨復合益生菌對大腸桿菌的抑制作用 益生菌作為動物體內(nèi)的一部分與機體的健康密切相關，其中一個很重要的作用就是抑制病原微生物的生長，維持腸道微生物區(qū)系平衡［10］。該研究結果表明，各種益生菌添加比例不同，其對大腸桿菌的抑制作用也不同，說明4種益生菌分別抑制大腸桿菌的能力有一定的差異，并存在一定的協(xié)同性。據(jù)報道，芽孢桿菌和乳酸菌之間利用生物奪氧和改變環(huán)境的酸堿度的方式進行協(xié)同抗菌［11－12］，與該研究結果相一致。

表1 復合益生菌組合對大腸桿菌的抑制效果

表2 復合益生菌與金霉素配伍對大腸桿菌的抑菌圈直徑

3.2 復合益生菌與金霉素聯(lián)合對大腸桿菌的抑制作用 該試驗所用的金霉素作為一種廣譜抗菌藥，對很多細菌都有抑制作用。但是，有研究表明有些益生菌的基因組內(nèi)存在抗性基因，對抗生素有一定的耐藥性［13－14］，這就為益生菌與抗生素的聯(lián)合使用提供了依據(jù)。該研究結果表明單獨益生菌對大腸桿菌的抑制作用要高于益生菌和75 mg/L的金霉素聯(lián)合作用的效果，并且當金霉素濃度高于75 mg/L時，聯(lián)合作用的效果都要高于單獨金霉素和單獨益生菌的作用。這說明復合益生菌對金霉素有一定的抵抗能力，同時也能與抗生素協(xié)同抑制大腸桿菌的生長。馬艷等［15］研究結果也表明益生菌可以與一些抗生素的聯(lián)合使用，并且益生菌的復合應用還可以降低單株菌對某些抗生素的敏感性，從而擴大了益生菌與抗生素配伍使用的范圍。

筆者通過益生菌和抗生素單獨及聯(lián)合使用，可以看出單獨益生菌對大腸桿菌生長的抑制作用與75～150 mg/L金霉素相當，說明復合益生菌具有低濃度金霉素的作用效果，而且聯(lián)合使用的效果要比單獨使用金霉素效果要好。在實際應用中，借助益生菌的聯(lián)合應用可以實現(xiàn)低劑量金霉素的添加，達到高劑量金霉素的效果。這對于減少抗藥和耐藥菌的產(chǎn)生、減少藥物殘留、維持機體微生態(tài)平衡及提高畜產(chǎn)品的安全性具有重要意義。

該試驗結果表明，當復合益生菌與金霉素聯(lián)合使用時，其抑菌效果要優(yōu)于單獨使用金霉素或益生菌。同時，可以使低劑量金霉素達到高劑量金霉素的抑菌效果，對于減少超級病原菌的產(chǎn)生及提高畜產(chǎn)品品質具有重要意義重大。

［1］楊云裳，薛飛群.抗生素飼料添加劑研究概況［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2000(5):38－40.

［2］尹清強，李小飛，常娟，等.微生態(tài)制劑對哺乳和斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響及作用機理研究［J］.動物營養(yǎng)學報，2011，23(4):622 －629.

［3］GOTCHEVA E，HRISTOZOVA E，HRISTOZOVA T，et al.Assessment of potential probiotic properties of Lactic acid bacteria and yeast strains［J］.Food Biotechnology，2002，16(3):211 －225.

［4］劉冬梅，李理，楊曉泉，等.用牛津杯法測定益生菌抑菌活力［J］.食品研究與開發(fā)，2006，27(3):110 －111.

［5］張民，刁其玉.益生菌的營養(yǎng)和免疫特性及其應用［J］.飼料研究，2002(10):6 －8.

［6］ZUBILLAGA M，WEILL R，POSTAIRE E，et al.Effect of probiotics and functional foods and their use in different diseases［J］.Nutrition Research，2001，21(3):569 －579.

［7］OSO AO，IDOWU OMO，HAASTRUP AS，et al.Growth performance，apparent nutrient digestibility，caecal fermentation，ileal morphology and caecal microflora of growing rabbits fed diets containing probiotics and prebiotics［J］.Livestock Science，2013，157(1):184 －190.

［8］呂東海，周巖民，王國華，等.益生素與抗生素對肉鴨生產(chǎn)性能影響的試驗［J］.廣東飼料，2001，10(6):16 －17.

［9］趙智華.抗生素與益生素組合對肉鴨生產(chǎn)性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2002，23(7):11 －13.

［10］TUOHY KM，PROBERT HM，SMEJKAL CW.Using probiotics and prebiotics to improve gut health［J］.Drug Discovery Today，2003，8(15):692 －700.

［11］李鐵軍，李愛云，張曉峰.乳酸菌抗菌機理研究進展［J］.微生物學通報，2002，29(5):81 －85.

［12］ASAHARA T，SHIMIZU K，NOMOTO K，et al.Probiotic bifidobacteria protect mice from lethal infect ion with Shiga toxin producing Escherichia coli 0157:H7［J］.Infection and Immunity，2004，72(4):2240 －2247.

［13］AIRES J，DOUCET-POPULAIRE F，BUTEL MJ.Tetracycline resistance mediated by tet(W)，tet(M)，and tet(O)genes of Bifidobacterium isolates from humans［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(8):2751－2754.

［14］EGERVARN M，ROOS S，LINDMARK H.Identification and characterization of antibiotic resistance genes in Lactobacillus reuteri and Lactobacillus plantarum［J］.Journal of Applied Microbiology，2009，107(5):1658 －1668.

［15］馬艷，常志州，朱萬寶，等.飼用益生菌對抗生素敏感性的試驗研究［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學，2002(5):50－52.