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        產(chǎn)高酸黑曲霉菌株篩選及生產(chǎn)應用

        2015-12-24 01:08:38高志林安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司安徽馬鞍山243051
        安徽農(nóng)業(yè)科學 2015年6期
        關鍵詞:產(chǎn)酸馬鞍山黑曲霉

        高志林 (安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司,安徽馬鞍山243051)

        檸檬酸具有令人愉悅的酸味,入口爽快,無后酸味,安全無毒,廣泛用作食品和飲料的酸味劑。檸檬酸工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)主要有表面(淺盤)發(fā)酵法、深層液體發(fā)酵法和固體發(fā)酵法[1]。隨著我國選育的耐高糖、耐高檸檬酸并具有抗金屬離子的黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸菌株被成功應用于深層液體發(fā)酵,目前國內(nèi)檸檬酸發(fā)酵主要方式是深層檸檬酸發(fā)酵。經(jīng)過多年發(fā)展,國內(nèi)檸檬酸發(fā)酵及提取技術趨于成熟,但受環(huán)保政策及銷售市場因素的影響,檸檬酸制造企業(yè)遇到新的挑戰(zhàn)。

        2013年我國檸檬酸(鹽)產(chǎn)能達170萬t,創(chuàng)歷史新高,占世界產(chǎn)能的80%,但全球檸檬酸需求量僅有150萬~160萬t,全球產(chǎn)能過剩70萬t,國內(nèi)檸檬酸產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益呈下滑趨勢[2],而玉米、煤炭、硫酸等主要輔料價格上升。因此,要趕超國內(nèi)檸檬酸生產(chǎn)標桿水平,開拓新的國際市場,就必須進行技術創(chuàng)新,提高發(fā)酵水平和下游提取效率。

        檸檬酸菌種的優(yōu)劣對于檸檬酸產(chǎn)率和生產(chǎn)成本具有重要作用,實現(xiàn)高產(chǎn)檸檬酸發(fā)酵,降低成本,檸檬酸菌種的馴化和選育是關鍵[3]。自我國生產(chǎn)檸檬酸以來,天津工藝微生物研究所、上海工業(yè)微生物研究所不斷推出適合不同原料的高產(chǎn)菌株,使?jié)饬细甙l(fā)酵指數(shù)的深沉發(fā)酵工藝不斷完善[4]。張洪勛[5]等統(tǒng)計表明,自2008年來,我國檸檬酸生產(chǎn)水平大幅提升,糧耗、成品收率及能源消耗等技術指標已優(yōu)于美國、西歐等同類企業(yè)的技術水平,達到世界先進行列。馮和志等調(diào)研表明,2012年檸檬酸行業(yè)發(fā)酵單罐產(chǎn)酸平均約為14.69%,發(fā)酵指數(shù)約為1.67,具有較大上升空間。隨著時間的推移,檸檬酸行業(yè)內(nèi)部分企業(yè)通過對發(fā)酵生產(chǎn)過程的優(yōu)化,目前宜興協(xié)聯(lián)公司發(fā)酵水平最優(yōu),其平均單罐產(chǎn)酸達15.89%,發(fā)酵糧耗約為1.562 t/t(該數(shù)據(jù)由國家發(fā)酵行業(yè)協(xié)會提供)。筆者為降低生產(chǎn)成本,采用選擇性條件進一步對黑曲霉菌株CO827進行馴化、篩選,將得到的高效率黑曲霉菌株用于實際生產(chǎn)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器 材料:CO827菌株(安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司),檸檬酸成品(安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司),耐高溫a-淀粉酶(諾維信公司),瓊脂、麩皮、糖液(安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司一車間),麥芽、土豆、尿素、發(fā)酵底料(安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司一車間),斐林試劑。

        儀器:智能霉菌培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學儀器有限公司),臥式壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司),搖瓶培養(yǎng)箱,無菌操作室等。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 培養(yǎng)基配制。

        1.2.1.1 梯度酸性培養(yǎng)基。4.5 Be麥芽汁200 ml,瓊脂 4 ~6 g;稱取檸檬酸 20、30 g,分別于 0.15 MPa滅菌 30 min。冷卻至45~55℃,混勻后做成酸度分別為10%、15%的酸性平板[6]。

        1.2.1.2 搖瓶培養(yǎng)基。取玉米粉250 g,加水定容至1 000 ml后,添加2 ml α-淀粉酶,加熱至90℃后保溫液化30 min,取其中90%混合物過濾所得清液與剩余的10%混合液混合(模擬生產(chǎn)發(fā)酵實際情況),以50 ml/瓶進行分裝滅菌。

        1.2.1.3 麩曲培養(yǎng)基。麥麩皮過篩去除細粉,用水洗至水清為止,用手擰至有水出而不滴水為止,以60 g/瓶進行分裝,于0.10 MPa滅菌30 min。

        1.2.2 糖度測定。吸取10 ml試樣于250 ml錐形瓶中,加入50 ml蒸餾水,7.5 ml濃H2SO4,裝上空氣或水冷凝回流管,加熱至沸,保持5 min,急速冷卻。冷卻后用30% ~40%NaOH溶液中和至pH 7.0~8.0,定容至500 ml,搖勻。取費林甲乙液各5 ml于50 ml錐形瓶中,加樣溶液2 ml于錐形瓶中,加適量0.1%葡萄糖標準溶液,控制瓶中液體在2 min內(nèi)沸騰,并保持微沸,然后以2~3 s/滴的速度滴至藍色消失,記錄葡萄糖標準液的體積??偺怯嬎愎剑?]:總糖(%)=(V1-V0)×2.5,式中,V0為空白體積,V1為檢測樣體積。

        1.2.3 檸檬酸酸度測定。取酸解液1 ml于150 ml錐形中,加適量蒸餾水,加濃度0.5%酚酞指示劑1~2滴,用0.142 9 mol/L NaOH溶液滴定至粉紅色,所用氫氧化鈉的體積(ml)即為樣品酸度[8]。

        1.2.4 產(chǎn)高酸黑曲霉篩選。將黑曲霉CO827菌株,接種于酸度10%的酸性平板中,在34~35℃的培養(yǎng)間中培養(yǎng)3 d,挑選生長優(yōu)良的單菌落接種于斜面試管中進行傳代培養(yǎng),然后對選出的7個菌株進行搖瓶培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度為34℃,搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min),經(jīng)培養(yǎng)72 h后測定酸度,選取轉(zhuǎn)化率高的菌株作為復篩菌株。然后用同樣方法將所得復篩菌株再進行酸度15%酸性平板和搖瓶培養(yǎng),最終得到CO827-0515-7菌株為最佳產(chǎn)酸菌株。

        1.2.5 黑曲霉CO827-0515-7菌株與原黑曲霉C0827菌株成本對比。將CO827-0515-7菌株進行傳代培養(yǎng),并接入麩曲中用于安徽豐原馬鞍山生物化學有限公司生產(chǎn),通過統(tǒng)計發(fā)酵運行數(shù)據(jù),將其與原黑曲霉CO827菌株進行生產(chǎn)成本對比。

        2 結果與分析

        2.1 初篩結果 用酸度10%平板篩選所得7個菌株,進行搖瓶培養(yǎng)測定48、72 h產(chǎn)酸情況,結果見表1。

        表1 搖瓶初篩試驗結果

        由表1可知,所得7個初篩菌株在48 h的鏡檢形態(tài)基本相同,但7號菌株48、72 h產(chǎn)酸優(yōu)于其他組別及對照組,因此選用7號菌株進行下一步的復篩試驗。

        2.2 復篩結果 用酸度15%平板對7號菌株進行培養(yǎng),選取平板中單菌落再進行搖瓶培養(yǎng),測定48、72 h產(chǎn)酸情況,結果見表2。

        由表2可知,試驗組產(chǎn)酸效果均優(yōu)于對照組,其中序號為0515-2和0515-7號菌株產(chǎn)酸效果最好。對比2菌株的48 h鏡檢結果可知,0512-2菌株的菌絲偏長,考慮其在大生產(chǎn)過程中,可能被具有剪切力的攪拌破碎較為嚴重,影響發(fā)酵罐溶氧效果,故選擇48h鏡檢菌絲較短的0515-7號菌株作為下一步篩選的菌株。

        表2 搖瓶復篩試驗結果

        2.3 復篩菌株產(chǎn)酸效果驗證 對選定的0515-7號菌株通過增設平行組,進行搖瓶培養(yǎng),測定48、72 h產(chǎn)酸情況,結果見表3。

        表3 產(chǎn)酸效果驗證

        由表3可知,0515-7號菌株產(chǎn)酸效果穩(wěn)定,且轉(zhuǎn)化率較高于對照組。

        2.4 生產(chǎn)成本分析 將CO827-0515-7菌株進行傳代培養(yǎng),并通過接種麩曲運用于該公司生產(chǎn)中,結果表明,使用CO827-0515-7號菌株后,發(fā)酵糧耗為1.561 t/t,與國內(nèi)發(fā)酵水平最優(yōu)的宜興協(xié)聯(lián)公司基本持平(1.562 t/t),發(fā)酵生產(chǎn)成本降低了82.95元/t。因目前馬鞍山公司自發(fā)酵壓濾后,產(chǎn)品收率約為92.3%,故折合檸檬酸成品總成本下降了76.60元/t,若以馬鞍山公司5.22萬t/年產(chǎn)量計算,則可減少總成本約合400萬元(表4)。

        表4 生產(chǎn)成本分析

        3 結論

        該研究通過梯度酸式平板篩選出具有高產(chǎn)酸、高糖酸轉(zhuǎn)化率等特點的CO827-0515-7號菌株,并成功運用于生產(chǎn)過程中,在未改變檸檬酸產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量和固有風味的基礎上,降低發(fā)酵生產(chǎn)成本約82.95元/t(清液),折合檸檬酸成品總成本下降了76.60元/t,僅馬鞍山公司每年度可降低成本400萬元。產(chǎn)高酸黑曲霉菌株CO827-0515-7篩選及生產(chǎn)應用,代表了生物發(fā)酵技術的一種創(chuàng)新,使安徽豐原馬鞍山公司的發(fā)酵技術水平在國內(nèi)處于領先地位。

        [1]高年發(fā),楊楓.我國檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的創(chuàng)新與發(fā)展[J].中國釀造,2010(7):1-6.

        [2]郭濤.國際五礦化工貿(mào)易[J].中國五礦化工進出口商會,2014,3(5):71-77.

        [3]孫榮,王燕,楊平平.檸檬酸發(fā)酵現(xiàn)狀及展望[J].中國調(diào)味品,2011,36(1):90 -92.

        [4]馮志合,盧濤.中國檸檬酸行業(yè)概況[J].中國食品添加劑,2011(3):158-163.

        [5]BJORN KRISTIAN.檸檬酸生物工藝學[M].張洪勛,譯.北京:中國科學技術出版社,2001:18 -26.

        [6]吳金鵬.食品微生物學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1994:235-240.

        [7]戚小靈,滕學東,左靜,等.檸檬酸發(fā)酵液中還原糖測定方法的探討[J].農(nóng)業(yè)機械,2011(23):141 -144.

        [8]王博彥,金其榮.發(fā)酵有機酸生產(chǎn)與應用手冊[M].北京:中國輕工業(yè)出版社,2000:297-299.

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