付立娟，高 陸，蘇 婷，牛耀祥，邊 雨，吳詩藝

(1.長春中醫(yī)藥大學，吉林長春130117;2.修正藥業(yè)集團新藥開發(fā)有限公司，吉林長春130012)

枳殼始載于《雷公炮炙論》，為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼揮發(fā)油具有促進胃排空和加快腸蠕動，對CaCl2、Ach及磷酸組織胺引起的痙攣性收縮有明顯的松弛作用，且能減少胃酸量及對抗大鼠幽門結扎性潰瘍的形成。枳殼揮發(fā)油中主要成分是檸檬烯。臨床上，檸檬烯具有抗腫瘤、治療膽囊炎等作用。另外，揮發(fā)油中另一重要成分芳樟醇，具有防腐、抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用［1］。

將枳殼揮發(fā)油制備成β-環(huán)糊精包合物，多數學者測定揮發(fā)油包合率的方法基本均為水蒸氣再蒸餾包合物法重回收揮發(fā)油計算包合率，且測定揮發(fā)油多用氣相色譜法［2］，而該試驗采用HPLC法測定揮發(fā)油中檸檬烯的含量，計算揮發(fā)油包合物，為枳殼揮發(fā)油包合率的測定提供高效、簡便、精確的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器 安捷倫高相液相色譜儀;島津 UV-2401PC紫外可見分光光度計;超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。

1.2 試劑試藥 枳殼購自石家莊市誠信中藥材有限公司;色譜甲醇;分析甲醇(北京化工);無水乙醇(北京化工);檸檬烯標準品(上海源葉生物科技有限公司，純度為98%，批號YF0225SA14)。

1.3 試驗方法

1.3.1 枳殼揮發(fā)油的提取。稱取適量枳殼藥材，粉碎成最粗粉，加4倍量水，連接揮發(fā)油提取裝置，加熱回流提取至揮發(fā)油不再增加時(約4 h)，停止加熱，放置0.5 h，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉脫水干燥，備用。

1.3.2 揮發(fā)油包合方法。采用研磨法包合揮發(fā)油，取一定量的β-環(huán)糊精，將揮發(fā)油用適量無水乙醇溶解，緩緩加入β-CD中，邊加邊研磨，再緩慢加入相當于β-環(huán)糊精3倍量的水研磨成糊狀，持續(xù)研磨一定時間后，適當溫度烘干，將干包合物研磨成細粉，即得［3］。

1.3.3 包合物中揮發(fā)油含量的測定。

1.3.3.1 高效液相色譜條件。色譜柱為ACE-C18(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)，以甲醇 - 水(75∶25)為流動相，流速1 ml/min，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃［4-5］。

1.3.3.2 對照品溶液的制備。精密稱取檸檬烯對照品0.076 0 g，置于 50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻，即1.489 6 mg/ml。精密移取上述溶液5 ml，置于50 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻，過濾，即得。

1.3.3.3 揮發(fā)油樣品的制備。精密吸取揮發(fā)油0.5 ml，置于5 ml容量瓶，甲醇溶解，定容，搖勻。精密吸取1 ml置50 ml容量瓶，甲醇定容，搖勻。精密吸取1 ml置10 ml容量瓶，甲醇定容，搖勻，即得。

1.3.3.4 供試品溶液的制備。取 β -CD 包合物0.1 g，精密稱定，置于25 ml容量瓶，加入甲醇20 ml，超聲處理30 min，取出，放置至室溫，甲醇定容，搖勻，過濾，即得。

1.3.3.5 檢測波長的確定。取“1.3.3.2”項下制備的對照品溶液，以甲醇為空白，采用紫外可見分光光度法在200～400 nm波長范圍內進行波長掃描。

1.3.4 方法學考察。

1.3.4.1 線性關系考察。分別精密吸取0.149 0 mg/ml的對照品溶液2、6、10、14、18 μl，按“1.3.3.1”色譜條件進樣。以峰面積Y為縱坐標、進樣體積為橫坐標，繪制檸檬烯對照品的標準曲線。

1.3.4.2 精密度試驗。取0.149 0 mg/ml的對照品溶液，進行精密度試驗，按“1.3.3.1”色譜條件操作，連續(xù)進樣6次，測定峰面積并計算RSD值。

1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗。取“1.3.3.4”項下制備的供試品溶液，于 0、2、4、6、8、10、15、20、25 h 進樣，通過測定峰面積，計算RSD值。

1.3.4.4 重現性試驗。取同一批枳殼揮發(fā)油包合物6份，每份0.1 g，精密稱定，按“1.3.3.4”項制備供試品溶液，按“1.3.3.1”色譜條件進樣測定，通過測定峰面積，計算 RSD 值。

1.3.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取已知檸檬烯含量的枳殼揮發(fā)油包合物6份，分別精密加入2 ml的濃度為1.489 6 mg/ml的對照品溶液，加入甲醇 18 ml，按“1.3.3.4”制備供試品溶液，按“1.3.3.1”色譜條件測定其含量，計算平均加樣回收率和RSD值。

1.3.5 正交試驗。通過查閱文獻，揮發(fā)油包合的常用方法有飽合水溶液法［6］、研磨法［7］、超聲法［8］3 種，試驗采用研磨法考察包合工藝。選擇β-CD用量、油:乙醇、研磨時間、烘干溫度4個因素為影響枳殼揮發(fā)油研磨法包合的主要因素，每個因素設定3個水平，進行L9(34)正交試驗(表1)。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2.1 枳殼揮發(fā)油的提取 按“1.3.1”方法操作，得到的枳殼揮發(fā)油為淡黃色，香氣濃郁，提取率約為2.0%。

2.2 檢測波長的確定 由圖1可知，檸檬烯在210 nm波長處有最大吸收，故選擇210 nm作為檢測波長。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察。由圖2可見，檸檬烯對照品的線性回歸方程為 Y=151.45X-14.125(R2=0.999 9)，表明當檸檬烯進樣體積在2～18 μl范圍內峰面積與進樣量呈線性關系，即濃度在0.029 8～0.268 2 mg/ml范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗。按照“1.3.4.2”操作，經過計算得峰面積RSD值為0.99%，表明試驗精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗。按照“1.3.4.3”操作，通過計算得供試品溶液檸檬烯峰在25 h內峰面積RSD值為1.11%，表明供試品溶液在25 h內時穩(wěn)定的。

2.3.4 重現性試驗。按照“1.3.4.4”操作，通過計算得檸檬烯峰面積RSD為0.76%，表明該供試品處理過程和分析方法均具有很好的重現性。

2.3.5 加樣回收率。從表2可以看出，平均加樣回收率為100.423 5%，RSD 值為1.37%，表明該方法準確、可靠，可用于枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的含量測定。

表2 加樣回收率試驗結果

2.4 正交試驗 由表3直觀分析結果顯示A2B1C2D3為最佳工藝，由方差分析(表4)得出各因素對包合率的影響程度為A＞D＞B＞C，其中β-糊精用量(A)對試驗結果有顯著性影響。結合各因素水平對試驗結果影響的效應曲線(圖3)，確定枳殼揮發(fā)油環(huán)糊精包合的最佳工藝為A3B1C2D3，即揮發(fā)油與環(huán)糊精的用量比為1∶10、揮發(fā)油與無水乙醇比例為1∶1、研磨時間為30 min、烘干溫度為60℃。

2.5 包合工藝的驗證性試驗 由于確定的最佳提取方案，在正交設計表中未出現，需進行工藝驗證性試驗。按最佳包合工藝，取揮發(fā)油2份，進行工藝驗證，工藝驗證結果(表5)經計算RSD值為0.15%，證明此包合方法結果穩(wěn)定可靠，可用于制備枳殼揮發(fā)油包合物，其高效液相譜圖如圖4所示。

表3 包合工藝正交試驗表與試驗結果

表4 方差分析結果

表5 工藝驗證結果

3 結論與討論

試驗結果表明，枳殼揮發(fā)油最佳包合工藝為10倍量β-環(huán)糊精，揮發(fā)油與無水乙醇1∶1混勻，研磨30 min，60℃烘干。該試驗建立了高相液相色譜法測定枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物中檸檬烯含量的方法，從而計算包合率的方法，并對該方法進行了方法學驗證。證明此方法簡單快速，且精密度高、回收率好，所得結果準確可靠，可用于枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物中檸檬烯含量的測定。而且經過穩(wěn)定性試驗證明，揮發(fā)油在25 h內穩(wěn)定，再次證明了枳殼揮發(fā)油采用高效液相色譜法測定的可行性。因此，該方法可以代替水蒸氣再蒸餾枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物計算包合率的方法，為揮發(fā)油環(huán)糊精包合率測定提供更為準確，可靠的檢測方法。

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