付立娟,高 陸,蘇 婷,牛耀祥,邊 雨,吳詩藝
(1.長春中醫(yī)藥大學,吉林長春130117;2.修正藥業(yè)集團新藥開發(fā)有限公司,吉林長春130012)
枳殼始載于《雷公炮炙論》,為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳殼揮發(fā)油具有促進胃排空和加快腸蠕動,對CaCl2、Ach及磷酸組織胺引起的痙攣性收縮有明顯的松弛作用,且能減少胃酸量及對抗大鼠幽門結扎性潰瘍的形成。枳殼揮發(fā)油中主要成分是檸檬烯。臨床上,檸檬烯具有抗腫瘤、治療膽囊炎等作用。另外,揮發(fā)油中另一重要成分芳樟醇,具有防腐、抗菌、抗病毒和鎮(zhèn)靜等作用[1]。
將枳殼揮發(fā)油制備成β-環(huán)糊精包合物,多數學者測定揮發(fā)油包合率的方法基本均為水蒸氣再蒸餾包合物法重回收揮發(fā)油計算包合率,且測定揮發(fā)油多用氣相色譜法[2],而該試驗采用HPLC法測定揮發(fā)油中檸檬烯的含量,計算揮發(fā)油包合物,為枳殼揮發(fā)油包合率的測定提供高效、簡便、精確的方法。
1.1 試驗儀器 安捷倫高相液相色譜儀;島津 UV-2401PC紫外可見分光光度計;超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司);分析天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)。
1.2 試劑試藥 枳殼購自石家莊市誠信中藥材有限公司;色譜甲醇;分析甲醇(北京化工);無水乙醇(北京化工);檸檬烯標準品(上海源葉生物科技有限公司,純度為98%,批號YF0225SA14)。
1.3 試驗方法
1.3.1 枳殼揮發(fā)油的提取。稱取適量枳殼藥材,粉碎成最粗粉,加4倍量水,連接揮發(fā)油提取裝置,加熱回流提取至揮發(fā)油不再增加時(約4 h),停止加熱,放置0.5 h,收集揮發(fā)油,用無水硫酸鈉脫水干燥,備用。
1.3.2 揮發(fā)油包合方法。采用研磨法包合揮發(fā)油,取一定量的β-環(huán)糊精,將揮發(fā)油用適量無水乙醇溶解,緩緩加入β-CD中,邊加邊研磨,再緩慢加入相當于β-環(huán)糊精3倍量的水研磨成糊狀,持續(xù)研磨一定時間后,適當溫度烘干,將干包合物研磨成細粉,即得[3]。
1.3.3 包合物中揮發(fā)油含量的測定。
1.3.3.1 高效液相色譜條件。色譜柱為ACE-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm),以甲醇 - 水(75∶25)為流動相,流速1 ml/min,檢測波長210 nm,柱溫25 ℃[4-5]。
1.3.3.2 對照品溶液的制備。精密稱取檸檬烯對照品0.076 0 g,置于 50 ml容量瓶,甲醇溶解,定容,搖勻,即1.489 6 mg/ml。精密移取上述溶液5 ml,置于50 ml容量瓶,甲醇溶解,定容,搖勻,過濾,即得。
1.3.3.3 揮發(fā)油樣品的制備。精密吸取揮發(fā)油0.5 ml,置于5 ml容量瓶,甲醇溶解,定容,搖勻。精密吸取1 ml置50 ml容量瓶,甲醇定容,搖勻。精密吸取1 ml置10 ml容量瓶,甲醇定容,搖勻,即得。
1.3.3.4 供試品溶液的制備。取 β -CD 包合物0.1 g,精密稱定,置于25 ml容量瓶,加入甲醇20 ml,超聲處理30 min,取出,放置至室溫,甲醇定容,搖勻,過濾,即得。
1.3.3.5 檢測波長的確定。取“1.3.3.2”項下制備的對照品溶液,以甲醇為空白,采用紫外可見分光光度法在200~400 nm波長范圍內進行波長掃描。
1.3.4 方法學考察。
1.3.4.1 線性關系考察。分別精密吸取0.149 0 mg/ml的對照品溶液2、6、10、14、18 μl,按“1.3.3.1”色譜條件進樣。以峰面積Y為縱坐標、進樣體積為橫坐標,繪制檸檬烯對照品的標準曲線。
1.3.4.2 精密度試驗。取0.149 0 mg/ml的對照品溶液,進行精密度試驗,按“1.3.3.1”色譜條件操作,連續(xù)進樣6次,測定峰面積并計算RSD值。
1.3.4.3 穩(wěn)定性試驗。取“1.3.3.4”項下制備的供試品溶液,于 0、2、4、6、8、10、15、20、25 h 進樣,通過測定峰面積,計算RSD值。
1.3.4.4 重現性試驗。取同一批枳殼揮發(fā)油包合物6份,每份0.1 g,精密稱定,按“1.3.3.4”項制備供試品溶液,按“1.3.3.1”色譜條件進樣測定,通過測定峰面積,計算 RSD 值。
1.3.4.5 加樣回收率試驗。精密稱取已知檸檬烯含量的枳殼揮發(fā)油包合物6份,分別精密加入2 ml的濃度為1.489 6 mg/ml的對照品溶液,加入甲醇 18 ml,按“1.3.3.4”制備供試品溶液,按“1.3.3.1”色譜條件測定其含量,計算平均加樣回收率和RSD值。
1.3.5 正交試驗。通過查閱文獻,揮發(fā)油包合的常用方法有飽合水溶液法[6]、研磨法[7]、超聲法[8]3 種,試驗采用研磨法考察包合工藝。選擇β-CD用量、油:乙醇、研磨時間、烘干溫度4個因素為影響枳殼揮發(fā)油研磨法包合的主要因素,每個因素設定3個水平,進行L9(34)正交試驗(表1)。
表1 正交試驗因素水平
2.1 枳殼揮發(fā)油的提取 按“1.3.1”方法操作,得到的枳殼揮發(fā)油為淡黃色,香氣濃郁,提取率約為2.0%。
2.2 檢測波長的確定 由圖1可知,檸檬烯在210 nm波長處有最大吸收,故選擇210 nm作為檢測波長。
2.3 方法學考察
2.3.1 線性關系考察。由圖2可見,檸檬烯對照品的線性回歸方程為 Y=151.45X-14.125(R2=0.999 9),表明當檸檬烯進樣體積在2~18 μl范圍內峰面積與進樣量呈線性關系,即濃度在0.029 8~0.268 2 mg/ml范圍內峰面積與質量濃度線性關系良好。
2.3.2 精密度試驗。按照“1.3.4.2”操作,經過計算得峰面積RSD值為0.99%,表明試驗精密度良好。
2.3.3 穩(wěn)定性試驗。按照“1.3.4.3”操作,通過計算得供試品溶液檸檬烯峰在25 h內峰面積RSD值為1.11%,表明供試品溶液在25 h內時穩(wěn)定的。
2.3.4 重現性試驗。按照“1.3.4.4”操作,通過計算得檸檬烯峰面積RSD為0.76%,表明該供試品處理過程和分析方法均具有很好的重現性。
2.3.5 加樣回收率。從表2可以看出,平均加樣回收率為100.423 5%,RSD 值為1.37%,表明該方法準確、可靠,可用于枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物的含量測定。
表2 加樣回收率試驗結果
2.4 正交試驗 由表3直觀分析結果顯示A2B1C2D3為最佳工藝,由方差分析(表4)得出各因素對包合率的影響程度為A>D>B>C,其中β-糊精用量(A)對試驗結果有顯著性影響。結合各因素水平對試驗結果影響的效應曲線(圖3),確定枳殼揮發(fā)油環(huán)糊精包合的最佳工藝為A3B1C2D3,即揮發(fā)油與環(huán)糊精的用量比為1∶10、揮發(fā)油與無水乙醇比例為1∶1、研磨時間為30 min、烘干溫度為60℃。
2.5 包合工藝的驗證性試驗 由于確定的最佳提取方案,在正交設計表中未出現,需進行工藝驗證性試驗。按最佳包合工藝,取揮發(fā)油2份,進行工藝驗證,工藝驗證結果(表5)經計算RSD值為0.15%,證明此包合方法結果穩(wěn)定可靠,可用于制備枳殼揮發(fā)油包合物,其高效液相譜圖如圖4所示。
表3 包合工藝正交試驗表與試驗結果
表4 方差分析結果
表5 工藝驗證結果
試驗結果表明,枳殼揮發(fā)油最佳包合工藝為10倍量β-環(huán)糊精,揮發(fā)油與無水乙醇1∶1混勻,研磨30 min,60℃烘干。該試驗建立了高相液相色譜法測定枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物中檸檬烯含量的方法,從而計算包合率的方法,并對該方法進行了方法學驗證。證明此方法簡單快速,且精密度高、回收率好,所得結果準確可靠,可用于枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物中檸檬烯含量的測定。而且經過穩(wěn)定性試驗證明,揮發(fā)油在25 h內穩(wěn)定,再次證明了枳殼揮發(fā)油采用高效液相色譜法測定的可行性。因此,該方法可以代替水蒸氣再蒸餾枳殼揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物計算包合率的方法,為揮發(fā)油環(huán)糊精包合率測定提供更為準確,可靠的檢測方法。
[1]舒尊鵬,胡書法,翟亞東,等.中藥枳殼化學成分及藥理作用研究[J].科技創(chuàng)新與應用,2012(7):8-9.
[2]潘馨.氣相色譜法測定綠衣枳殼中檸檬烯的含量[J].海峽藥學,2004,16(5):68-69.
[3]師白梅,嚴建業(yè),王元清,等.當歸、枳殼揮發(fā)油的提取與包合工藝研究[J].中南藥學,2012,10(6):401-405.
[4]張瑞倫,張慶,徐世艾.HPLC法測定留蘭香油中檸檬烯[J].安徽農業(yè)科學,2012,40(2):743-744.
[5]滕建業(yè).枳殼促進胃動力化學物質組的篩選及作用機理研究[D].沈陽:遼寧中醫(yī)藥大學,2011.
[6]楊小催,柯雪紅,陳錦富,等.石菖蒲揮發(fā)油包合工藝及包合物穩(wěn)定性研究[J].中藥新藥與臨床藥理,2010,21(2):202-205.
[7]張貽昌,黃桂福,笪賢偉,等.參附益心顆粒揮發(fā)油包合物的制備[J].中藥材,2010,33(12):1956-1957.
[8]林三清,陳智蕊,楊紅艷,等.廣藿香揮發(fā)油包合物制備方法的比較研究[J].中成藥,2009,31(12):1944.