徐國鑫　李效尊　劉蓬　尹靜靜　吳修

摘要：通過組織切片制片和染色方法改進(jìn)，建立了能夠清晰顯示藕的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的技術(shù)體系，并在此基礎(chǔ)上分析了淀粉粒、維管束和分泌細(xì)胞的分布規(guī)律。

關(guān)鍵詞：藕；組織切片；顯微結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)：S645.101

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A

文章編號(hào)：1001-4942（2015）10-0029-04

蓮是睡蓮科多年生水生草本植物，藕是其膨大的根狀莖，藕營養(yǎng)成分豐富，是我國優(yōu)良的特色蔬菜和副食佳品。藕的地方品種數(shù)量繁多，品質(zhì)各有特色。隨著我國人民生活水平的改善，消費(fèi)者對(duì)藕品質(zhì)的要求日益提高，其品質(zhì)性狀成為蓮藕育種和食品領(lǐng)域?qū)＜谊P(guān)注的重點(diǎn)。

以往對(duì)于藕品質(zhì)的研究，主要從測(cè)定其所含糖類、淀粉、纖維素等成分入手，而針對(duì)其細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)含物質(zhì)分布規(guī)律的研究比較缺乏。石蠟切片技術(shù)被廣泛應(yīng)用于植物組織結(jié)構(gòu)研究，但是對(duì)于不同特性的植物樣品，需要對(duì)制片和染色方法進(jìn)行改進(jìn)。目前尚未見藕石蠟切片制作技術(shù)相關(guān)研究的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，蓮藕細(xì)胞內(nèi)含有大量淀粉粒，使用蕃紅、固綠和甲苯胺藍(lán)等傳統(tǒng)染色方法對(duì)藕的石蠟切片進(jìn)行染色，效果不夠理想。為此筆者經(jīng)過多次試驗(yàn)探索出PAS反應(yīng)-甲苯胺藍(lán)雙重染色的方法，它能清晰顯示出藕的細(xì)胞壁、維管束和淀粉粒等結(jié)構(gòu)，從而可增進(jìn)對(duì)蓮藕組織結(jié)構(gòu)的了解，也為進(jìn)一步研究其發(fā)育過程和貯藏物質(zhì)積累規(guī)律提供必要技術(shù)手段。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

蓮藕雜交品系由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究中心培育，種植于該院飲馬泉試驗(yàn)基地。2014年12月設(shè)三個(gè)取樣點(diǎn)挖取其膨大的地下莖，選其節(jié)段中部為供試材料。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1所需試劑 ①FAA固定液：50%乙醇：福爾馬林：冰醋酸=90：5：5。②席夫（Sehiff）試劑：稱取堿性品紅0.5g，加入蒸餾水100mL，沸水浴加熱溶解5min，冷卻至室溫后經(jīng)濾紙過濾，加入偏亞硫酸氫鈉1g和濃鹽酸2mL，充分混勻后避光密封保存，約24h后試劑變成淺黃色即可使用。③改良甲苯胺藍(lán)染色液：稱取甲苯胺藍(lán)0.5g，加入30%乙醇100mL，加熱至65℃，攪拌30min，過濾后避光保存。

1.2.2制片 石蠟切片方法參照田晨霞等的方法并進(jìn)行改進(jìn)，具體步驟為：

①固定：將蓮藕莖段中部切成厚度2mm的薄片，浸入FAA固定液中，用真空泵抽氣20min，固定12h以上。

②脫水：依次通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%、75%、95%、100%梯度乙醇溶液，100%乙醇溶液需更換3次，每次2h。依次通過體積比為50%、75%、100%梯度乙醇/二甲苯溶液，100%二甲苯溶液需更換3次，每次2h。

③浸蠟：將樣品浸入50%石蠟/二甲苯溶液中，置于60℃烘箱，6h后將50%石蠟/二甲苯溶液吸出，換全蠟3次，每次6h。將樣品倒入包埋模具中，冷卻至室溫。

④切片：在轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)上切成厚度為10μm切片，置于載玻片上，40℃展片；載玻片上的水分徹底蒸發(fā)后，用二甲苯脫蠟、無水乙醇浸洗。

⑤復(fù)水：依次通過質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%、95%、75%、50%和30%梯度乙醇溶液。

1.2.3染色 以傳統(tǒng)的甲苯胺藍(lán)染色法作為對(duì)照，使用PAS-甲苯胺藍(lán)染色法對(duì)藕石蠟切片進(jìn)行染色，具體步驟如下：

①PAS染色：參考Bronner的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。將粘附有切片的載玻片浸入0.4%（W/W）的高碘酸鉀溶液中處理20min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗3次，每次2min；浸入Sehiff試劑中染色20min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次1min。

②甲苯胺藍(lán)染色：將載玻片浸入改良甲苯胺藍(lán)染色液中，染色10min，自來水沖洗，蒸餾水浸洗2次，每次1min，35℃烘干。中性樹膠封片，鏡檢拍照。

2結(jié)果與分析

2.1染色效果比較

在顯微鏡下觀察傳統(tǒng)甲苯胺藍(lán)染色法染色后的藕石蠟切片（圖1），可以看到，甲苯胺藍(lán)對(duì)不同成分的著色特異性較差，只能將淀粉粒和薄壁細(xì)胞染為淡藍(lán)色（圖1A），并且對(duì)表皮細(xì)胞著色過深（圖1B），無法看清細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)情況。

使用PAS-甲苯胺藍(lán)雙重染色法獲得的切片，細(xì)胞形態(tài)飽滿，細(xì)胞壁被染為藍(lán)色，細(xì)胞內(nèi)的淀粉粒被染為紫紅色，維管束、氣腔和分泌細(xì)胞等結(jié)構(gòu)清晰（圖2B）。本方法不但能夠區(qū)分不同組織和結(jié)構(gòu)的分布情況，而且染色效果穩(wěn)定，經(jīng)封片后可以保存數(shù)月而不褪色。

2.2藕組織結(jié)構(gòu)觀察

以最外層的細(xì)胞為第1層細(xì)胞，依次向內(nèi)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞層數(shù)。藕的表皮共有2層細(xì)胞構(gòu)成，其細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞內(nèi)不含淀粉粒；其中第1層細(xì)胞的內(nèi)含物較少，第2層細(xì)胞被黑褐色物質(zhì)充滿，可能是由酚類物質(zhì)在制片過程中受到氧化形成的（圖2B）。從第3層細(xì)胞開始呈現(xiàn)薄壁細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞體積和內(nèi)部淀粉粒的體積逐層增大（圖3、圖4），至第6層細(xì)胞之后，細(xì)胞呈相間排列，分層不明顯。薄壁細(xì)胞之間散在分布有維管束，靠近表皮的維管束較細(xì)（圖2C）；靠近內(nèi)側(cè)的維管束較粗，有2～3層維管束鞘細(xì)胞包圍，內(nèi)部含有氣腔（圖2D）。

此外，在薄壁細(xì)胞之間分布有少量的分泌細(xì)胞（圖2B、圖2D），分泌細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)在切片制作過程中氧化成黑褐色的顆粒，推測(cè)這些物質(zhì)中含有較多的酚類，可能與藕食品加工過程中的褐化現(xiàn)象有關(guān)。

3討論與結(jié)論

本研究改進(jìn)組織切片染色方法后，能清晰顯示出藕的組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的石蠟切片染色方法，使用蕃紅、固綠和蘇木精等染料，若染色條件控制不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致染色不足和染色過度。本研究改為雙重染色法，首先使用PAS反應(yīng)將淀粉染成鮮紅色，再用甲苯胺藍(lán)將細(xì)胞壁染為藍(lán)色（淀粉粒也輕微著色而變成紫紅色），染色效果清晰穩(wěn)定（圖2）。

淀粉的含量和性質(zhì)與藕的品質(zhì)密切相關(guān)。本試驗(yàn)建立的組織制片技術(shù)體系能夠清晰地顯示淀粉粒的分布，對(duì)研究蓮藕淀粉的積累規(guī)律和評(píng)價(jià)蓮藕種質(zhì)資源均有重要意義。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)藕表皮細(xì)胞和分泌細(xì)胞中含有的物質(zhì)氧化后變?yōu)楹诤稚?，這些物質(zhì)可能與藕烹飪過程中的褐化現(xiàn)象有關(guān)，需要進(jìn)一步探明褐化物質(zhì)的成分和積累規(guī)律。本研究成果為在細(xì)胞生物學(xué)水平上研究蓮藕品質(zhì)性狀奠定了基礎(chǔ)，我們將結(jié)合其它技術(shù)手段解析影響蓮藕品質(zhì)的構(gòu)成因素，推動(dòng)蓮藕品質(zhì)育種進(jìn)步。endprint