李娟　申軍艷　陳楓　聶銘　王俊　王豐青　陳新建　張重義

摘要：通過對地黃生長過程中乙烯合成及轉(zhuǎn)運途徑的干擾，減輕地黃化感自毒作用的效果，為消減地黃連作障礙提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。在地黃重茬地塊選取6個小區(qū)，分別以乙烯合成抑制劑氨氧乙酸（AOAA）、乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯（1-MPC）的3個濃度進行處理，并選取正茬、重茬地黃作為對照，根據(jù)地黃的死亡率、生長指標(biāo)、相對電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、根系活力等指標(biāo)探討阻斷植株體內(nèi)乙烯釋放對連作地黃生長的影響。結(jié)果表明，經(jīng)乙烯抑制劑1-MCP、AOAA處理的地黃植株，與重茬對照植株相比死亡率明顯降低、相對電導(dǎo)率減小、超氧化物歧化酶活性增加、根系活力增加、植株生長狀況得到改善。乙烯抑制劑1-MCP、AOAA對地黃生長過程中乙烯的合成途徑造成干擾，從而減輕地黃連作障礙。

關(guān)鍵詞：地黃；連作障礙；乙烯；氨氧乙酸（AOAA）；1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）

中圖分類號： S567.23+9.04 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0332-04

連作障礙即重茬問題，已嚴(yán)重影響我國藥用植物的生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)化進程，據(jù)統(tǒng)計，藥用植物中約70%的根類藥材在生產(chǎn)中均存在連作障礙[1]。地黃（Rehmannia glutinosa L.）為玄參科多年生草本植物，是我國著名的“四大懷藥”之一，也是根類藥材中連作障礙最為嚴(yán)重的典型代表之一。地黃種植1年之后需隔8～10年方可再種，連作時可表現(xiàn)為植株生長不良，塊根不能正常膨大，產(chǎn)量、品質(zhì)明顯下降，甚至絕收[2]。為探究地黃連作障礙的產(chǎn)生原因和機理，通過土壤環(huán)境監(jiān)測、植株生理生化指標(biāo)測定、正茬及重茬地黃cDNA差異轉(zhuǎn)錄組文庫的構(gòu)建、響應(yīng)地黃連作障礙關(guān)鍵基因和特定miRNAs的篩選鑒定，基本確定了“化感物質(zhì)→鈣信號傳導(dǎo)途徑→乙烯產(chǎn)生→染色質(zhì)修飾→基因表達抑制→DNA、RNA、蛋白質(zhì)合成受阻→植物傷害表現(xiàn)”，這可能為地黃體內(nèi)涉及連作毒害信號的感知、傳導(dǎo)、響應(yīng)、效應(yīng)的“毒害機理”[3-8]。

前期研究證明，鈣信號系統(tǒng)與乙烯合成系統(tǒng)的關(guān)鍵基因在連作地黃中均得到了高水平表達[9]。通過研究鈣信號調(diào)控對地黃連作障礙的影響，探索地黃連作障礙的消減技術(shù)。結(jié)果表明，經(jīng)IP3抑制劑、鈣釋放通道抑制劑處理后，鈣信號響應(yīng)元件的CBL、CBP、CIBP、PLC等關(guān)鍵基因的表達均顯著下調(diào)；對不同處理植株表型的調(diào)查也表明，鈣阻斷后的植株生物量顯著高于未被阻斷的對照植株[10]。目前，基于植物鈣信號調(diào)節(jié)的化學(xué)調(diào)控大多處于理論研究階段。乙烯是一種重要的內(nèi)源性植物激素，具有生物活性和復(fù)雜的生物學(xué)功能，并調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和許多生理生化過程，也被認(rèn)為是一種脅迫應(yīng)答激素，其合成及信號傳導(dǎo)途徑已在很多植物中被證實[11-12]。利用乙烯抑制劑對抗植物早熟，從而延長存放時間，已被廣泛應(yīng)用于果蔬、花卉保鮮行業(yè)[13-15]。本研究利用乙烯抑制劑控制連作地黃生長過程中乙烯的釋放，從而切斷化感自毒物質(zhì)的信號傳導(dǎo)過程，以減輕地黃連作障礙。

為證明關(guān)于連作障礙“毒害機理”的推斷，探明干擾乙烯合成及釋放途徑對連作地黃生長的影響，以連作地黃為試驗材料，外援施加乙烯合成抑制劑氨氧乙酸（AOAA）、乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP），從而控制重茬地黃體內(nèi)乙烯的含量，測定受試地黃的產(chǎn)量、死亡率、相對電導(dǎo)率、超氧化物歧化酶（SOD）活性、根系活力等指標(biāo)，以期闡明地黃連作障礙的作用機理，為消減技術(shù)體系的建立提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

供試地黃品種為溫85-5；塊根繁殖材料蘆頭（種栽）由溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，經(jīng)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)高致明教授鑒定為地黃（Rehmannia glutinosa L.）。氨氧乙酸（AOAA）購自西安永泰生物科技有限公司，1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）購自蘭州嘉誠生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

試驗于2013年4—10月在溫縣農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗田內(nèi)進行。供試塊根大小一致、部位相同，種植前經(jīng)多菌靈浸種處理。于地黃種植后70 d開始試驗，AOAA濃度設(shè)1.00、0.50、0.25 mmol/L，分別進行灌根；1-MCP濃度設(shè)0.20、010、0.05 g/L，于塑料棚內(nèi)熏蒸處理12 h，為防止高溫期密閉傷害，熏蒸處理于傍晚至翌日清晨進行。每個濃度選擇20株地黃進行處理，每隔1周處理1次，共處理6次，另設(shè)正茬、重茬地黃作為對照。每次處理前調(diào)查受試地黃的死亡率，并測定其地上部直徑作為生長指標(biāo)。從首次處理后1周開始，測定受試地黃葉片的SOD活性和相對電導(dǎo)率。于最后1次處理結(jié)束后1周進行采收。

1.3 測定項目

每次處理前，記錄地黃地上部直徑、死亡植株數(shù)量，并測定其SOD活性和相對電導(dǎo)率。SOD活性的測定參照文獻[16]，并進行改良；相對電導(dǎo)率的測定參照文獻[17]。以上生理指標(biāo)每個處理取樣10株，剪取地黃植株地上部分進行測定，重復(fù)測定3次。于最后一次處理結(jié)束后1周進行采收，采收時測定地黃的根系活力、地上部分鮮質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量。根系活力的測定參照鄭堅等的方法[18]，重復(fù)3次。

采用IBM SPSS 19.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯抑制劑對連作地黃死亡率及生長指標(biāo)的影響

由圖1可知，乙烯抑制劑處理對連作地黃的死亡率影響較大，采收時死亡率為0.25 mmol/L AOAA>0.05 g/L 1-MCP>重茬>0.50 mmol/L AOAA>1.00 mmol/L AOAA>020 g/L 1-MCP>0.10 g/L 1-MCP >正茬。1.00 mmol/L AOAA處理的植株，前期死亡率高于未經(jīng)處理的重茬地黃，第4次處理前死亡率已低于重茬地黃；0.50 mmol/L AOAA處理的植株，前期死亡率接近于重茬地黃，第4次處理后死亡率開始低于重茬地黃；0.10 g/L 1-MCP處理的植株，前期死亡率接近于重茬地黃，第3次處理后死亡率開始低于重茬地黃；020 g/L 1-MCP處理的植株，死亡率始終低于重茬地黃，表明1-MCP處理對抑制連作地黃乙烯釋放具有更好、更快的效果。然而，在0.25 mmol/L AOAA、0.05 g/L 1-MCP處理組，第1次施藥后1周的死亡率高于重茬地黃，且整個生長期的死亡率均高于重茬地黃，至采收時死亡率達100%?？梢?，低濃度乙烯抑制劑不能減緩地黃的連作障礙，反而在一定程度上增加其連作發(fā)病率，這與廣泛存在于生物生長發(fā)育過程中的Hormesis效應(yīng)相吻合。Hormesis效應(yīng)別稱小劑量刺激效應(yīng)，即很多化合物在不同濃度時出現(xiàn)的“低促高抑”現(xiàn)象[19]。試驗結(jié)果表明，施加低濃度乙烯抑制劑反而刺激了受試地黃乙烯的釋放，致使連作地黃的死亡率增加。endprint

由圖2可知，乙烯抑制劑對受試地黃地上部直徑的影響較小，不同濃度、類型的乙烯抑制劑均可在一定程度上提高受試地黃的地上部直徑，且各濃度1-MCP的處理效果優(yōu)于同等濃度的AOAA，但遠(yuǎn)未達到正茬地黃的水平，且與重茬地黃的地上部直徑差異不顯著。正茬地黃、重茬地黃的地上部直

徑最高值分別出現(xiàn)于8月23日、8月16日，而經(jīng)乙烯抑制劑處理的受試地黃，其地上部直徑最高值的出現(xiàn)日期與正茬地黃一致或更晚?？梢姡夭绲攸S存在早衰現(xiàn)象，而乙烯抑制劑可在一定程度上能緩解早衰。

乙烯抑制劑對受試地黃的地上、地下鮮質(zhì)量影響較大，其塊根鮮質(zhì)量依次為正茬>1.00 mmol/L AOAA>0.20 g/L 1-MCP>0.50 mmol/L AOAA>0.10 g/L 1-MCP>重茬（表1）。經(jīng)1.00 mmol/L AOAA處理的受試地黃，其存活植株的地下塊根鮮質(zhì)量平均值為100.5 g，幾乎達到正茬地黃的水平，與重茬地黃差異極顯著，連作障礙消減率達62.8%；其次為0.20 g/L 1-MCP處理組，其平均地下塊根鮮質(zhì)量為54.1 g，與重茬地黃差異顯著，連作障礙消減率達32.5%。

2.2 乙烯抑制劑對連作地黃SOD活性的影響

SOD活性的高低代表植物抵御逆境能力的大小。由表2可知，正茬和經(jīng)過處理的受試地黃的SOD活性均呈先增強、后減弱、再增強的趨勢。于首次施用乙烯抑制劑后1周進行第1次測量，經(jīng)處理的受試地黃SOD活性均大幅高于重茬地黃，并接近或高于正茬地黃，此趨勢保持至8月9日（第2次施用后1周）；之后，所有受試地黃的SOD活性均顯著降低，且同期正茬、重茬地黃的SOD活性均有所降低，死亡率持續(xù)上升，此期恰為地黃生育期中各種病害的高發(fā)期。8月30日之后，正茬和經(jīng)高濃度、中濃度乙烯抑制劑處理的受試地黃，其SOD活性又增強至正常水平。試驗結(jié)果表明，乙烯抑制劑AOAA、1-MCP處理能夠切斷植株對化感自毒物質(zhì)的響應(yīng)程序，增強SOD活性，從而減輕地黃連作障礙。

2.3 乙烯抑制劑對連作地黃細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性的增加與很多逆境因素有關(guān)，其數(shù)值的大小標(biāo)志著逆境的強弱，也標(biāo)志著植株的抗逆能力。在本試驗中，地黃的細(xì)胞膜透性由葉片的相對電導(dǎo)率表示。由表3可知，正茬地黃相對電導(dǎo)率的變化趨勢為先降低后升高再降低，于8月9日開始升高，至8月16日出現(xiàn)1個高峰期，相對電導(dǎo)率達到69.1%，但在8月23日很快回落至25.8%，表明此期間是地黃生長過程中逆境最嚴(yán)重的時期，但脅迫時間較短，傷害較小，地黃尚可恢復(fù)至正常水平。經(jīng)0.20、0.10 g/L 1-MCP處理的受試地黃植株，其相對電導(dǎo)率的變化趨勢與正茬地黃相似，受試植株的電導(dǎo)率于8月16日達到高峰值后可較快恢復(fù)至正常水平。而經(jīng)AOAA處理的受試地黃，其相對電導(dǎo)率的變化趨勢更接近于重茬地黃，恢復(fù)能力相對較慢。重茬地黃的相對電導(dǎo)率最高值出現(xiàn)于8月16日，達到79.7%，但其相對電導(dǎo)率在整個生長過程中均處于較高水平，始終高于正茬地黃，表明重茬地黃不僅受到生長過程中短暫的溫度、干濕度、病蟲害等環(huán)境脅迫，而始終處于逆境脅迫的環(huán)境中。

2.4 乙烯抑制劑對連作地黃根系活力的影響

前期研究結(jié)果表明，地黃根區(qū)土壤中潛在的化感物質(zhì)抑制了地黃根系的生長，使根系呼吸作用減弱、脫氫酶活性減弱，根系活力越小則地黃連作障礙越嚴(yán)重[20]。在本試驗中，正茬地黃的根系活力明顯高于重茬地黃，根系活力值依次為正茬>1.0 mmol/L AOAA>0.2 g/L 1-MCP>0.1 g/L 1-MCP>0.5 mmol/L AOAA>重茬。施用乙烯抑制劑可提高連作地黃的根系活力，經(jīng)0.2 g/L 1-MCP、1.0 mmol/L AOAA處理的連作地黃根系活力值分別提高至1.457、1.425 μg/（g·h），接近正茬水平（表4）。

3 結(jié)論與討論

在連作過程中，地黃對化感自毒物質(zhì)具有感知、傳導(dǎo)、響應(yīng)、效應(yīng)幾個關(guān)鍵階段，化感物質(zhì)所引起的基因和蛋白的異常表達是地黃連作障礙的根本原因。前期研究發(fā)現(xiàn)，乙烯前體SAM合成酶1Z71、ACC氧化酶1V38在重茬地黃中顯著上調(diào)，兩者均在根部高水平表達，且高峰期出現(xiàn)在塊根膨大期，由此推測這2種酶均是產(chǎn)生乙烯的關(guān)鍵酶，而乙烯可能是引起地黃連作障礙的直接原因[9]。本研究通過試驗證明，施用乙烯阻斷劑1-MCP、AOAA可增加地黃的抗逆性，減輕地黃連作障礙。

目前，生產(chǎn)中主要采用3種方式進行乙烯調(diào)控。利用乙烯清除劑，通過吸收乙烯氣體從而降低環(huán)境中乙烯的濃度；利用乙烯合成抑制劑，從乙烯生物合成過程S-腺苷蛋氨酸（SAM）-氨基環(huán)丙烷羧酸（ACC）-乙烯（Eth）中的2個關(guān)鍵步驟來抑制合成；利用乙烯作用抑制劑競爭植物體內(nèi)的受體，通過其與乙烯受體可逆或不可逆地結(jié)合，阻礙乙烯與受體的正常結(jié)合，進而抑制其所誘導(dǎo)的生理生化過程[21]。由于連作地黃主要是化感自毒物質(zhì)引起的內(nèi)源乙烯增加，本研究選取乙烯合成抑制劑AOAA、乙烯受體抑制劑1-MCP對乙烯進行調(diào)控。結(jié)果表明，低濃度的1-MCP（0.05 g/L）、AOAA（0.25 mmol/L）處理可增加地黃的連作障礙；中、高濃度的1-MCP（0.10～0.20 g/L）、AOAA（0.50～1.00 mmol/L）處理對地黃的連作障礙具有一定的消減效應(yīng)，作用效果隨施加濃度的增加而逐漸增強。

雖然AOAA可減少植物內(nèi)源乙烯的釋放，但對環(huán)境中的乙烯卻無能為力，因此在實際生產(chǎn)中具有一定的局限性。1-MCP 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型乙烯受體抑制劑，通過與乙烯受體的不可逆結(jié)合抑制內(nèi)源乙烯的生理效應(yīng)，并抑制外源乙烯對內(nèi)源乙烯的誘導(dǎo)作用，目前已作為STS的替代品在國內(nèi)外大規(guī)模使用[13-15]。本試驗中，經(jīng)1-MCP處理的受試植株在成活率、地上部直徑、葉片SOD活性、相對電導(dǎo)率等方面的作用效果均優(yōu)于AOAA處理，但其地下塊根生物量卻明顯低于AOAA處理，這可能與化感自毒物質(zhì)的作用部位及方式有關(guān)。前期試驗中，根據(jù)乙烯合成關(guān)鍵酶的表達水平、表達部位推斷，連作地黃根部產(chǎn)生的乙烯通過維管組織運送至地上部，從而表現(xiàn)出相應(yīng)毒害作用并引起早衰現(xiàn)象[9]。在本試驗中，AOAA處理直接作用于植株根部，而1-MCP在自然狀態(tài)下為氣態(tài)，需在密閉空間中使用，因此1-MCP處理采用熏蒸方式，更多作用于植株地上部分；AOAA處理直接抑制乙烯形成的源頭，而1-MCP處理主要針對轉(zhuǎn)運后的結(jié)果。endprint

藥用植物的連作障礙極為復(fù)雜，且土壤因成分復(fù)雜被研究者稱為“黑匣子”，消除連作障礙并對其進行調(diào)控絕非易事。本研究證實，通過干擾地黃生長過程中乙烯的合成途徑，能夠阻礙化感自毒物質(zhì)的信號傳導(dǎo)，進而抑制特異基因的不正常表達，減輕化感自毒物質(zhì)對植物的毒害作用，消減地黃連作障礙。在抑制地黃乙烯的合成及轉(zhuǎn)運途徑方面僅進行了探索性研究，尚需對施用方式、施用時間、作用濃度進行深入研究，以便將此方法大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)中。隨著對地黃連作障礙分子機理研究的深入，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培養(yǎng)出抑制乙烯合成的地黃品種，在基因水平上阻斷化感自毒物質(zhì)的作用，有可能成為更簡單的方式。

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