季祥　成杰　廖利民　鞏東輝　蔡祿　齊云　陳冠益

摘要：為了促進(jìn)微藻快速生長(zhǎng)、提高微藻生物量，在試驗(yàn)室條件下對(duì)1株含油量相對(duì)較高、長(zhǎng)勢(shì)較好的斜生柵藻進(jìn)行10 L擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)對(duì)4種主要營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在擴(kuò)大培養(yǎng)的10 L反應(yīng)器中，斜生柵藻的最適生長(zhǎng)條件為：NaNO3 1.0 g/L、K2HPO4·3H2O 0.10 g/L、MgSO4·7H2O 0.100 g/L、FeCl3·6H2O 0.008 g/L，斜生柵藻在該優(yōu)化后的10 L培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況良好，且最大生物量（D680 nm）可達(dá)1.91，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的1.20、1.28倍。

關(guān)鍵詞：斜生柵藻；擴(kuò)大培養(yǎng)；生物量；生長(zhǎng)條件；優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào)： Q968.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0303-03

隨著人類(lèi)社會(huì)資源的短缺和環(huán)境問(wèn)題的日益突出，世界各國(guó)正面臨著能源匱乏和生態(tài)環(huán)境破壞的危機(jī)，因此尋求一種新型的可再生能源成為世界各國(guó)科學(xué)家普遍關(guān)注的科學(xué)問(wèn)題和發(fā)展趨勢(shì)[1]。生物柴油是清潔的、環(huán)境友好的可再生能源，但由于其原材料成本較高，目前生物柴油的價(jià)格仍高于傳統(tǒng)柴油。而在眾多的能源微生物中，微藻具有種類(lèi)繁多、光合利用度高、自身合成油脂能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。利用藻類(lèi)油脂生產(chǎn)生物柴油具有緩解溫室效應(yīng)，不與人爭(zhēng)糧、不與糧爭(zhēng)地的眾多優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)微藻油轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物柴油具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景。為了快速獲得較大的微藻生物量，對(duì)微藻的擴(kuò)大培養(yǎng)顯得至關(guān)重要，而在不同反應(yīng)器中，微藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求也不一樣。因此，筆者對(duì)試驗(yàn)室的1株含油量較高的斜生柵藻進(jìn)行了10 L擴(kuò)大培養(yǎng)研究，對(duì)其生長(zhǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最大限度地提高該藻的生物量，為其工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種來(lái)源

試驗(yàn)藻種為斜生柵藻（Scenedesmus obliquus），保存于內(nèi)蒙古自治區(qū)生物質(zhì)能源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用10 L廣口瓶為反應(yīng)器，以前期工作[3]改進(jìn)的BG11培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為7 L，接種量5%，置于環(huán)境溫度（25±1） ℃、光照強(qiáng)度5 000 lx、光照周期14 L/10 d的條件下培養(yǎng)。

1.3 微藻生物量的測(cè)定

微藻生物量的測(cè)定采用濁度比色法[4]。本試驗(yàn)采用752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的吸光度（D680 nm），試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 17.0、Origin Pro 8.0和Microsoft Office Excell 2007軟件進(jìn)行分析處理。

1.4 斜生柵藻生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

1.4.1 4種主要營(yíng)養(yǎng)鹽單因子試驗(yàn) 試驗(yàn)對(duì)影響斜生柵藻生長(zhǎng)最主要的N、P、Mg、Fe營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行研究，在接種前1 d分別換上不加N、P、Mg、Fe營(yíng)養(yǎng)鹽的改進(jìn)BG11培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h 后按0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L的質(zhì)量濃度加入NaNO3，按0、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 g/L的質(zhì)量濃度加入K2HPO4·3H2O，按0、0.050、0.075、0.100、0.125 g/L的質(zhì)量濃度加入MgSO4·7H2O，按0、0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 g/L的質(zhì)量濃度加入FeCl3·6H2O。每組均作3個(gè)平行試驗(yàn)，待微藻處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，取最大的D680 nm平均值，考察在不同濃度的N、P、Mg、Fe營(yíng)養(yǎng)鹽條件下斜生柵藻的生長(zhǎng)情況。

1.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，按表1因素水平表中各水平分別加入NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O和FeCl3·6H2O營(yíng)養(yǎng)鹽，參照正交試驗(yàn)法[5]選用L9（34）設(shè)計(jì)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaNO3對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

微藻在增殖過(guò)程中需要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氮是微藻體內(nèi)許多重要有機(jī)化合物的組成成分之一，在許多方面影響植物的代謝過(guò)程和生長(zhǎng)發(fā)育。其中，氮是微藻細(xì)胞蛋白質(zhì)葉綠素的組成成分，是組成核酸的重要元素之一，同時(shí)微藻體內(nèi)的各種生物酶也含有氮[6]。微藻在生長(zhǎng)過(guò)程中通常能利用銨鹽、硝酸鹽及尿素作氮源，本試驗(yàn)以NaNO3為氮源，在培養(yǎng)基中加入不同質(zhì)量濃度的NaNO3，考察不同質(zhì)量濃度的NaNO3在10 L培養(yǎng)體系中對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖1所示。

從整體上看，隨著NaNO3質(zhì)量濃度的不斷增加，斜生柵藻的生物量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。利用軟件分析可知，NaNO3質(zhì)量濃度與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），且各組間生物量差異顯著（P<0.05）。當(dāng)NaNO3質(zhì)量濃度為0時(shí)，生物量最低；隨著NaNO3質(zhì)量濃度的增加，柵藻生物量逐漸上升，當(dāng)質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)，斜生柵藻生物量在各組間最大，D680 nm為1.59，而持續(xù)增加NaNO3質(zhì)量濃度并不能促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，生物量開(kāi)始逐漸降低，說(shuō)明過(guò)高質(zhì)量濃度的NaNO3會(huì)抑制斜生柵藻的生長(zhǎng)。由此得出，NaNO3最適質(zhì)量濃度為1.0 g/L（圖1）。

2.2 K2HPO4·3H2O對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育心需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，是微藻體內(nèi)許多有機(jī)化合物的組成成分，同時(shí)磷以多種方式參與微藻體內(nèi)的各種代謝過(guò)程，是生物體內(nèi)ATP、GTP、核酸、磷脂、輔酶等化合物合成的基本元素，在微藻生長(zhǎng)發(fā)育中起重要的作用。本試驗(yàn)以K2HPO4·3H2O為磷源，研究不同質(zhì)量濃度的K2HPO4·3H2O對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度在0～0.14 g/L范圍內(nèi)均能促進(jìn)斜生柵藻生長(zhǎng)，且生物量與其呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。當(dāng)K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度為0～0.10 g/L時(shí)，磷鹽對(duì)斜生柵藻生物量的促進(jìn)作用明顯，同時(shí)在0.10 g/L時(shí)生物量達(dá)到最大；而當(dāng)K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度大于0.10 g/L 時(shí)，該藻的生物量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但隨著磷鹽質(zhì)量濃度緩慢增加，柵藻生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的耐受性。因此，在10 L培養(yǎng)體系中，斜生柵藻的K2HPO4·3H2O最適質(zhì)量濃度為 0.10 g/L。endprint

2.3 MgSO4·7H2O對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)影響

鎂是葉綠素的組成成分，在葉綠素合成和光合作用中起重要作用[7]，鎂還參與生物體內(nèi)的氮代謝和活性氧代謝。在試驗(yàn)中選取MgSO4·7H2O提供鎂元素，研究不同質(zhì)量濃度的Mg2+對(duì)斜生柵藻擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，斜生柵藻在不同質(zhì)量濃度的MgSO4·7H2O條件下所達(dá)到的最大生物量有所差異。當(dāng)培養(yǎng)液中不含鎂時(shí)，斜生柵藻生物量較低，當(dāng)培養(yǎng)液中鎂元素存在時(shí)，可見(jiàn)其生物量迅速增加，由軟件分析可知，鎂質(zhì)量濃度與微藻生物量是顯著正相關(guān)的（P<0.01），同時(shí)含有Mg2+與缺鎂條件下的生物量差異顯著（P<0.05）。而當(dāng)MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度達(dá)0.05 g/L后，生物量表現(xiàn)出一定程度的先下降后上升的趨勢(shì)，但趨勢(shì)較緩，增量不明顯，差異也不顯著（P>0.05）。這可能主要是由于培養(yǎng)液中持續(xù)鎂質(zhì)量濃度的增加，對(duì)微藻生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定的抑制作用，同時(shí)由于微藻機(jī)體自身的耐受能力，在微藻適應(yīng)了較高質(zhì)量濃度下的Mg2+后，出現(xiàn)一定程度的生長(zhǎng)現(xiàn)象，可以推測(cè)后續(xù)持續(xù)增加鎂質(zhì)量濃度會(huì)造成微藻生物量急劇降低。綜合以上分析結(jié)果可知，0.100 g/L為 MgSO4·7H2O 的最適質(zhì)量濃度。

2.4 FeCl3·6H2O對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

鐵元素在微藻生理上有重要作用，是一些重要的氧化-還原酶催化部分的組分。鐵雖然不是葉綠素的組成成分，但缺鐵時(shí)，葉綠體的片層結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，嚴(yán)重時(shí)甚至使葉綠體發(fā)生崩解。而且鐵在微藻體內(nèi)以各種形式與蛋白質(zhì)結(jié)合，作為重要的電子傳遞體或催化劑參與許多生命活動(dòng)。本試驗(yàn)以FeCl3·6H2O為鐵鹽，考察不同質(zhì)量濃度的Fe3+對(duì)斜生柵藻擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，盡管培養(yǎng)液中對(duì)Fe3+含量要求較低，但對(duì)微藻生物量的影響很大。由軟件分析結(jié)果可知，F(xiàn)e3+與斜生柵藻生物量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）。當(dāng)培養(yǎng)液中缺鐵時(shí)，斜生柵藻生物量較低；FeCl3·6H2O的增加能夠迅速促進(jìn)微藻生物量的積累，當(dāng)FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度達(dá)0.006 g/L時(shí)，生物量達(dá)到最高，D680 nm為1.59；而隨著質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，微藻生物量開(kāi)始降低，表現(xiàn)出抑制作用。說(shuō)明適宜的Fe3+質(zhì)量濃度能夠促進(jìn)微藻細(xì)胞增殖，有利于生物量積累。因此，F(xiàn)eCl3·6H2O的最適質(zhì)量濃度為0.006 g/L。

2.5 4種營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)影響程度和優(yōu)化水平組合

在不同條件下，斜生柵藻對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽的需求有很大的差異，為了研究斜生柵藻在擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)的最佳培養(yǎng)基配比，采用正交設(shè)計(jì)對(duì)這4種營(yíng)養(yǎng)鹽進(jìn)行多因子組合試驗(yàn)，按表1因素水平表分別加入營(yíng)養(yǎng)鹽，在10 L反應(yīng)器中培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，4種營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響程度從大到小為A>D>B>C，即NaNO3質(zhì)量濃度>FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度>K2HPO4·3H2O質(zhì)量濃度>MgSO4·7H2O質(zhì)量濃度，NaNO3質(zhì)量濃度水平對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響最大，其次為FeCl3·6H2O質(zhì)量濃度。通過(guò)分析4因素的均值可知，4種營(yíng)養(yǎng)鹽的最優(yōu)水平組合為A2B2C2D3，即NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、0.008 g/L，通過(guò)后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證可知，斜生柵藻在該優(yōu)化條件下的生物量D680 nm可達(dá)1.91，是各試驗(yàn)設(shè)計(jì)組中最高的。此外，在正交試驗(yàn)中4種營(yíng)養(yǎng)鹽的最適質(zhì)量濃度與單因素的最適質(zhì)量濃度相吻合的有NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O，而FeCl3·6H2O較單因素試驗(yàn)中的質(zhì)量濃度不同，這可能是由于各因素的交互作用所致。因此，以正交試驗(yàn)分析所得的最適優(yōu)化組合培養(yǎng)基對(duì)斜生柵藻進(jìn)行10 L擴(kuò)大培養(yǎng)，可以獲得斜生柵藻的最大生物量。

2.6 斜生柵藻在不同培養(yǎng)條件的生長(zhǎng)情況

為了進(jìn)一步驗(yàn)證斜生柵藻10 L擴(kuò)大培養(yǎng)的最佳營(yíng)養(yǎng)鹽條件，將經(jīng)正交試驗(yàn)所得的營(yíng)養(yǎng)鹽條件與BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)條件分別在250 mL以及10 L培養(yǎng)體系下進(jìn)行微藻整個(gè)生長(zhǎng)周期的培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，斜生柵藻均能在3種不同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，總體生長(zhǎng)趨勢(shì)相當(dāng)，前6 d為調(diào)整期，6～15 d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，18 d以后斜生柵藻逐漸進(jìn)入到穩(wěn)定生長(zhǎng)期，27 d后藻細(xì)胞開(kāi)始衰亡；在優(yōu)化后的10 L培養(yǎng)體系條件下，斜生柵藻生長(zhǎng)趨

勢(shì)明顯好于其余2組，且穩(wěn)定期收獲的生物量最大，D680 nm可達(dá)1.91，遠(yuǎn)高于10 L-BG11、250 mL-BG11條件下的D680 nm（1.58）、D680 nm（1.48），分別是該2組的1.20、1.28倍。此外，在外界環(huán)境條件、營(yíng)養(yǎng)鹽條件相同的情況下，微藻反應(yīng)體系對(duì)其生長(zhǎng)影響較大，250 mL體系生物量小于10 L體系，這可能是由于較大反應(yīng)器更有利于微藻的生長(zhǎng)繁殖，特別是在微藻生長(zhǎng)繁殖后期，由于微藻細(xì)胞密度不斷增大，光遮蔽效應(yīng)日益明顯，微藻生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境空間以及營(yíng)養(yǎng)鹽的需求表現(xiàn)得更加突顯。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、0.100、0.006 g/L。在10 L反應(yīng)體系中，NaNO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeCl3·6H2O的最佳質(zhì)量濃度為1.0、0.10、010、0.008 g/L。后續(xù)試驗(yàn)證明，斜生柵藻在10 L-優(yōu)化培養(yǎng)中的生物量遠(yuǎn)高于BG11基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別是10 L-BG11、250 mL-BG11培養(yǎng)條件的1.20、1.28 倍，同時(shí)10 L反應(yīng)體系更利于微藻生長(zhǎng)繁殖和生物量的積累，該研究也為微藻的擴(kuò)大培養(yǎng)提供了依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：endprint

[1]Brennan L，Owende P. Biofuels from microalgae-a review of technologies for production，processing，and extractions of biofuels and co-products[J]. Renewable and Sustainable Energy Reviews，2010，14（2）：557-577.

[2]Singh A，Nigam P S，Murphy J D. Renewable fuels from algae：an answer to debatable land based fuels[J]. Bioresource Technology，2011，102（1）：10-16.

[3]季 祥，王金榮，丁 瀟，等. 一株斜生柵藻的篩選及生長(zhǎng)條件的優(yōu)化[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2010，37（6）：265-268.

[4]Mandotra S K，Kumar P，Suseela M R，et al. Fresh water green microalga Scenedesmus abundans：a potential feedstock for high quality biodiesel production[J]. Bioresource Technology，2014，156（101）：42-47.

[5]倪海兒. 生物試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析[M]. 北京：科學(xué)出版社，2013：156-160.

[6]Seppl J，Tamminen T，Kaitala S. Experimental evaluation of nutrient limitation of phytoplankton communities in the Gulf of Riga[J]. Journal of Marine Systems，1999，23（1/2/3）：107-126.

[7]Huber S C，Maury W. Effects of magnesium on intact chloroplasts[J]. Plant Physiol，1980，65：350-354.張美德，艾倫強(qiáng)，盧 超，等. 硒對(duì)鎘脅迫下白術(shù)幼苗生理特性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：306-308.endprint