柴虹　潘海珠　胡浩

摘要：為了確定酪酸梭菌與糞腸球菌混合培養(yǎng)方法，從2種菌接種順序及接種時(shí)間、混合培養(yǎng)基中碳源、氮源添加比例等方面進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，混合培養(yǎng)基中葡萄糖添加0.5%、酵母粉添加0.8%、酪酸梭菌接種混合培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后接種糞腸球菌、混合培養(yǎng)20 h后酪酸梭菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)稍高，芽孢率稍有下降；混合培養(yǎng)的糞腸球菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)大幅增加，為單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的2.4倍。

關(guān)鍵詞：酪酸梭菌；糞腸球菌；混合培養(yǎng)；動(dòng)物腸道

中圖分類號(hào)： Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0279-02

酪酸梭菌又名丁酸梭菌，是農(nóng)業(yè)部近幾年新批準(zhǔn)使用的高安全性添加劑品種，該菌能調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌落平衡，抑制腸道有害菌生長(zhǎng)[1-2]。該菌分泌的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)酪酸（丁酸）能修復(fù)受損傷的腸黏膜，促進(jìn)其再生[3-5]。乳酸糞腸球菌是目前微生態(tài)制劑主要菌種之一，該菌可與動(dòng)物腸道中有益微生物共生，具有改善動(dòng)物胃腸道環(huán)境、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和提高生產(chǎn)性能等作用[6]。這2種菌在動(dòng)物飼養(yǎng)領(lǐng)域均具有很高的利用價(jià)值。通過(guò)長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐，人們發(fā)現(xiàn)有些益生菌之間有共生作用，發(fā)酵產(chǎn)物可以互為利用，從而達(dá)到互利共棲的效果。已有研究表明酪酸梭菌與乳酸菌混合培養(yǎng)可顯著提高生物量和生理代謝功能，能產(chǎn)生優(yōu)于純培養(yǎng)的效果。王松麗等研究表明，酪酸梭菌與鼠李糖乳桿菌混合培養(yǎng)生物量大幅提高，混合培養(yǎng)液對(duì)常見腸道致病菌具有更強(qiáng)的抑菌活性[7]。呂存女等試驗(yàn)證明，酪酸梭菌與嬰兒雙歧桿菌兩菌聯(lián)合比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)顯示出更強(qiáng)的生物拮抗作用[8]。本試驗(yàn)在2種菌單獨(dú)培養(yǎng)技術(shù)成熟的基礎(chǔ)上，嘗試將其混合培養(yǎng)，探索酪酸梭菌與乳酸糞腸球菌的共生關(guān)系。結(jié)果表明，兩者在混合培養(yǎng)基中表現(xiàn)出互惠共生的關(guān)系，其生物量均有提高。該方法用于大生產(chǎn)中可提高產(chǎn)率、降低成本，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 酪酸梭菌（Clostridium butyricum）JYS-1株、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）JYS-2株，以上2個(gè)菌株為江蘇遠(yuǎn)山生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室保留菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 糞腸球菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨3 g/L，胰酪蛋白胨17 g/L，酵母粉5 g/L，牛膽粉10 g/L，氯化鈉5 g/L，七葉苷1 g/L，檸檬酸鐵胺0.5 g/L，疊氮化鈉0.25 g/L，檸檬酸鈉1 g/L，瓊脂粉15 g/L；pH值6.9～7.3。

1.1.2.2 酪酸梭菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉8 g/L，氯化鈉2 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，瓊脂粉15 g/L；pH值 6.5 。

1.1.2.3 混合培養(yǎng)基：酵母粉8 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，碳酸鈣5 g/L，吐溫80（1 mL/L），硫酸鎂0.5 g/L，pH值7.0。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 pH計(jì)、立式壓力蒸汽滅菌器、鼓風(fēng)干燥箱、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、OXOID厭氧產(chǎn)氣罐、渦旋混合儀等。

1.2 方法

1.2.1 菌種接種順序及時(shí)間 酪酸梭菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)，在接種菌種7～9 h后開始產(chǎn)氣，培養(yǎng)26～28 h時(shí)菌數(shù)和芽孢率均達(dá)到理想狀態(tài)。糞腸球菌單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)無(wú)遲緩期，接種菌種后很快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)20～22 h后菌數(shù)達(dá)到最大值。根據(jù)以上生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)分為4種組合，分別為：A：酪酸梭菌與糞腸球菌同時(shí)接種；B：酪酸梭菌培養(yǎng)6 h后接種糞腸球菌；C：酪酸梭菌培養(yǎng)8 h后接種糞腸球菌；D：酪酸梭菌培養(yǎng)10 h后接種糞腸球菌。分別對(duì)酪酸梭菌和糞腸球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)比較，并比較酪酸梭菌的芽孢率。

1.2.2 混合培養(yǎng)基主要成分的優(yōu)化

1.2.2.1 葡萄糖 固定培養(yǎng)基中其他成分不變，改變葡萄糖濃度（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%等4個(gè)梯度），根據(jù)酪酸梭菌和糞腸球菌活菌數(shù)確定葡萄糖最佳添加量。

1.2.2.2 酵母粉 固定培養(yǎng)基中其他成分不變，改變酵母粉濃度（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%等4個(gè)梯度），根據(jù)酪酸梭菌和糞腸球菌活菌數(shù)確定酵母粉最佳添加量。

1.2.3 混合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)比較 確定好混合培養(yǎng)基的配方與混合培養(yǎng)方案后，單獨(dú)培養(yǎng)酪酸梭菌、單獨(dú)培養(yǎng)糞腸球菌、混合培養(yǎng)酪酸梭菌和糞腸球菌，將單獨(dú)培養(yǎng)和混合培養(yǎng)的酪酸梭菌和糞腸球菌分別計(jì)數(shù)，并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種接種順序及時(shí)間

因酪酸梭菌是芽孢菌，穩(wěn)定期相對(duì)較長(zhǎng)，而糞腸球菌在穩(wěn)定期后菌體衰亡較嚴(yán)重，故混合培養(yǎng)時(shí)間主要依據(jù)糞腸球菌培養(yǎng)時(shí)間來(lái)定。分別在混合培養(yǎng)18、20、22 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，結(jié)果見表1。由表1可以看出，同時(shí)接種酪酸梭菌菌種液與糞腸球菌菌種液，酪酸梭菌得不到充分的生長(zhǎng)，酪酸梭菌培養(yǎng)6 h后接種糞腸球菌菌種液也是如此，酪酸梭菌培養(yǎng)10 h后接種糞腸球菌菌種液雖然酪酸梭菌數(shù)量較高，但酪酸梭菌芽孢率在后期相對(duì)于C組有所下降，同時(shí)糞腸球菌的數(shù)量也下降1個(gè)數(shù)量級(jí)，而酪酸梭菌培養(yǎng)8 h后接種糞腸球菌菌種液是最佳培養(yǎng)方案。

2.2 混合培養(yǎng)基主要成分優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 葡萄糖 葡萄糖添加量分為0.2%、0.5%、0.8%和1.0%4個(gè)梯度，培養(yǎng)基其他成分不變，酪酸梭菌培養(yǎng)8 h后接種糞腸球菌菌種液，混合培養(yǎng)20 h后采樣進(jìn)行2種菌活菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，葡萄糖添加量在0.2%時(shí)菌數(shù)相對(duì)較少，0.5%、0.8%、1.0%菌數(shù)差別不明顯（表2），最終確定葡萄糖添加量為0.5%。

2.2.2 酵母粉 酵母粉添加量分為0.2%、0.5%、0.8%和1.0%四個(gè)梯度，培養(yǎng)基其它成分不變，酪酸梭菌培養(yǎng)8h后接種糞腸球菌菌種液，混合培養(yǎng)20 h后采樣進(jìn)行2種菌活菌計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，酵母粉添加量在0.2%、0.5%時(shí)菌數(shù)相對(duì)較少，0.8%、1.0%菌數(shù)差別不明顯（表3），最終確定酵母粉添加量為0.8%。endprint

2.2.3 混合培養(yǎng)與單獨(dú)培養(yǎng)比較結(jié)果 由表4可見酪酸梭菌單獨(dú)培養(yǎng)26 h，活菌數(shù)1.5×108 CFU/mL，芽孢率92.4%。糞腸球菌單獨(dú)培養(yǎng)20 h，活菌數(shù)2.6×108 CFU/mL。酪酸梭菌培養(yǎng)8 h接種糞腸球菌菌種液，混合培養(yǎng)20 h，酪酸梭菌活菌數(shù)2.2×108 CFU/mL，芽孢率91.2%，糞腸球菌6.2×108 CFU/mL。該結(jié)果顯示，混合培養(yǎng)的酪酸梭菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)稍高，芽孢率稍有下降；混合培養(yǎng)的糞腸球菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)大幅增加，為單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的2.4倍。

3 分析與結(jié)論

實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)酪酸梭菌與糞腸球菌的單獨(dú)培養(yǎng)工藝已經(jīng)基本成熟。在此基礎(chǔ)上，合理安排2種菌的接種順序及接種時(shí)間，改善培養(yǎng)基中碳源、氮源的添加比例，最終達(dá)到高效混合培養(yǎng)2種菌的最終目的。因酪酸梭菌是芽孢菌，穩(wěn)定期相對(duì)較長(zhǎng)，而糞腸球菌在穩(wěn)定期后菌體衰亡較嚴(yán)重，故混合培養(yǎng)時(shí)間主要依據(jù)糞腸球菌培養(yǎng)時(shí)間來(lái)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，混合培養(yǎng)基中添加葡萄糖0.5%，添加酵母粉0.8%，酪酸梭菌接種混合培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h后接種糞腸球菌，混合培養(yǎng)20 h后酪酸梭菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)稍高，芽孢率稍有下降；混合培養(yǎng)的糞腸球菌活菌數(shù)比單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)大幅增加，為單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)的2.4倍。

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