康立超　盧春霞　劉長(zhǎng)彬

摘要：對(duì)分布于天山北坡的4個(gè)集約化奶牛場(chǎng)進(jìn)行了乳房炎發(fā)病情況和病原學(xué)研究。結(jié)果顯示，通過(guò)對(duì)300頭產(chǎn)奶牛和1 162份奶樣的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)臨床乳房炎頭數(shù)陽(yáng)性率為11.2%，乳區(qū)陽(yáng)性率為8.0%，主要病原菌有無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動(dòng)鞘氨醇單胞菌，均有較高的耐藥性。隱性乳房炎頭數(shù)陽(yáng)性率為73.24%，乳區(qū)陽(yáng)性率為42.91%，病原菌較雜（少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌、坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產(chǎn)硫球鏈菌、玫瑰色庫(kù)克菌、奈瑟菌），對(duì)常見(jiàn)抗生素有敏感性。由以上結(jié)果可見(jiàn)，天山北坡集約化牛場(chǎng)臨床型乳房炎和隱性乳房炎的發(fā)病率較高，且臨床型乳房炎致病菌對(duì)抗生素均有較高的耐藥性。

關(guān)鍵詞：奶牛；乳房炎；病原菌；分離鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.237.2+6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0271-04

奶牛乳房炎是奶牛的一種常見(jiàn)多發(fā)性疾病，發(fā)生乳房炎的奶牛產(chǎn)奶量下降，牛奶品質(zhì)降低，干擾正常繁殖機(jī)能，病情嚴(yán)重時(shí)造成奶?；疾∪閰^(qū)廢棄、失去泌乳能力而被淘汰，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。引起奶牛乳房炎的因素很多，可由創(chuàng)口、環(huán)境微生物、傳染性微生物等引起，其中傳染性病原微生物引起的乳房炎最為常見(jiàn)，危害最大[1]。奶牛乳房炎的病原體有80～130種，其中主要為無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、霉形體、乳房鏈球菌、大腸桿菌、化膿桿菌等。據(jù)調(diào)查，無(wú)癥狀的隱性乳房炎發(fā)病率更高，約占整個(gè)牛群的50%，其中約90%由鏈球菌和葡萄球菌引起[2]。本試驗(yàn)針對(duì)天山北坡地區(qū)的4個(gè)奶牛場(chǎng)進(jìn)行了乳房炎的調(diào)查和病原的分離與鑒定，以期找出導(dǎo)致該地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 來(lái)自天山北坡養(yǎng)牛經(jīng)濟(jì)帶的4個(gè)奶牛場(chǎng)的300頭產(chǎn)奶牛乳樣。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基，BHI培養(yǎng)基，普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；奶牛隱性乳房炎臨床診斷（CMT）試劑，購(gòu)自北京福茂大地商貿(mào)有限公司。

1.1.3 儀器 VITEK-2全自動(dòng)生化鑒定儀，精密恒溫培養(yǎng)箱，乳品分析儀（Lactoscan 5557），體細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Nucleo Counter SCC-100）。

1.2 方法

1.2.1 奶樣的采集及分析 分別從4個(gè)奶牛場(chǎng)的擠奶廳里，隨機(jī)確定采樣奶牛。先用溫水拭凈采樣乳區(qū)皮膚，再用75%乙醇消毒，采用無(wú)菌操作擠奶，棄去頭3把奶，用無(wú)菌瓶分別收集4個(gè)乳區(qū)的乳樣，每個(gè)乳區(qū)采集約30 mL，低溫冷藏保存，4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳品品質(zhì)分析和體細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 乳房炎的檢測(cè) 在乳樣采集時(shí)，先用溫水擦洗奶牛乳房，擦洗過(guò)程中注意觀察乳房是否有不同程度的充血、腫脹、發(fā)硬、發(fā)熱，尤其觀察是否有疼痛感。若有以上癥狀，在擠奶過(guò)程中要特別注意，并記錄牛號(hào)，觀察乳汁有無(wú)變稀薄，且有無(wú)絮狀物或凝塊，以及膿汁和血液，若有以上癥狀并結(jié)合乳房變化判定為臨床乳房炎。如果眼觀無(wú)明顯變化，則在反應(yīng)盤(pán)留取奶樣2 mL左右，加入等量的CMT診斷液，緩慢搖動(dòng)，使奶樣與診斷液充分混合，觀察凝集現(xiàn)象并記錄結(jié)果，按CMT判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每個(gè)檢樣進(jìn)行判定是否為隱性乳房炎。

1.2.3 細(xì)菌的分離培養(yǎng)和染色鏡檢 將判定為臨床乳房炎的10份乳樣（L1至L10）和隱性乳房炎的10份乳樣（Y1至Y10），分別取0.1 mL均勻涂布于5%綿羊鮮血瓊脂平板上，放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～48 h。培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基上有無(wú)菌落生長(zhǎng)，觀察在不同培養(yǎng)基上所形成單個(gè)菌落的形態(tài)特征、溶血及生長(zhǎng)情況等，對(duì)不同形態(tài)的菌落進(jìn)行涂片、染色、鏡檢。在鮮血平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)特征、溶血及生長(zhǎng)情況等一致，染色鏡檢結(jié)果相同的暫歸為同一種菌；在同一個(gè)平板上同一病料初次接種生長(zhǎng)的同一種菌，菌苔和菌落數(shù)量明顯較多的歸為優(yōu)勢(shì)菌株。

1.2.4 生化鑒定 分離到的不同種類(lèi)的細(xì)菌，根據(jù)革蘭氏染色情況，革蘭氏陽(yáng)性菌上GP生化鑒定卡，革蘭氏陰性菌上GN生化鑒定卡。按照VITEK-2說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行生化鑒定。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將純化優(yōu)勢(shì)菌株的單菌落接種到BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，用滅菌棉簽均勻涂布于5%綿羊鮮血平板上，再分別貼上藥敏紙片37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察對(duì)常用獸藥（阿奇霉素、頭孢噻肟鈉、氨芐西林鈉、慶大霉素、氧氟沙星、泰樂(lè)菌素、克林霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、鏈霉素、青霉素G）的敏感性（藥敏紙片藥品含量與判定標(biāo)準(zhǔn)參考杭州天和微生物試劑有限公司）。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)查概況

本試驗(yàn)共采集300頭產(chǎn)奶牛的1 162份乳樣，其中有38個(gè)乳區(qū)瞎。其中，臨床乳房炎陽(yáng)性的乳樣，由于奶性質(zhì)變化較大，未檢測(cè)乳品品質(zhì)和體細(xì)胞計(jì)數(shù)。經(jīng)檢測(cè)，奶牛生鮮乳平均體細(xì)胞在78.06萬(wàn)/mL，非脂乳固體為7.75 g/100 g（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≥8.1 g/100 g），密度1.026 g/mL 20 ℃/4 ℃（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≥1.027），蛋白質(zhì)為2.86 g/100 g（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≥2.8 g/100 g），脂肪為4.28 g/100 g（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≥3.1 g/100 g），冰點(diǎn)為-0.48 ℃（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為-0.5～-0.56 ℃），雜質(zhì)度為2.5 mg/L（國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)為≤4.0 mg/L），礦物質(zhì)為0.73 g/100 g。

2.2 奶牛乳房炎發(fā)病率

通過(guò)對(duì)300頭產(chǎn)奶牛臨床診斷和乳汁變化分析，臨床乳房炎結(jié)果按乳區(qū)計(jì)算的發(fā)病率為8.0%，按牛頭數(shù)計(jì)算為11.2%。用CMT法檢測(cè)隱性乳房炎發(fā)病率，按乳區(qū)計(jì)算為42.81%，按牛頭數(shù)計(jì)算為73.24%。

2.3 細(xì)菌的分離鑒定

通過(guò)對(duì)20份乳樣的細(xì)菌培養(yǎng)，10份臨床乳房炎乳樣品中，培養(yǎng)均發(fā)現(xiàn)有病原菌存在，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到8株細(xì)菌（A1至A8）；隱性乳房炎的10份乳樣，在5%綿羊鮮血平板培養(yǎng)有8份發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌生長(zhǎng)，2份未發(fā)現(xiàn)任何細(xì)菌生長(zhǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征、溶血和染色鏡檢情況等挑選分離得到10株細(xì)菌（B1至B10）。將分離到的18株菌，根據(jù)革蘭氏染色情況，用VITEK-2 Compact鑒定出10種不同的細(xì)菌（表1），主要有：無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、少動(dòng)鞘氨醇單胞菌、溶血葡萄球菌、陰道加特納菌、西宮皮球菌/坐皮膚球菌、口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌、產(chǎn)硫球鏈菌、玫瑰色庫(kù)克菌、奈瑟菌。少動(dòng)鞘氨醇菌在臨床乳房炎和隱性乳房炎乳樣中都被分離到。臨床乳房炎乳樣中還分離到無(wú)乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌，其他菌均只在隱性乳房炎乳樣中分離到。通過(guò)表2細(xì)菌分布情況可以看出，臨床乳房炎中無(wú)乳鏈球菌占70%、金黃色葡萄球菌占80%和少動(dòng)鞘氨醇單胞菌占50%，為主要優(yōu)勢(shì)病原菌。隱性乳房炎中少動(dòng)鞘氨醇單胞菌占40%，溶血葡萄球菌占30%，西宮皮球菌/坐皮膚球菌占30%，口腔鏈球菌/緩癥鏈球菌占40%，玫瑰色庫(kù)克菌、產(chǎn)硫球鏈菌、陰道加特納菌和奈瑟菌各占10%。因此，病原菌較復(fù)雜，沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)病原菌。endprint

2.5 藥敏試驗(yàn)

金黃色葡萄球菌全部耐藥，無(wú)乳鏈球菌對(duì)青霉素有敏感性，少動(dòng)鞘氨醇單胞菌對(duì)慶大霉素和氧氟沙星有敏感性，溶血葡萄球菌對(duì)氧氟沙星和恩諾沙星有敏感性，玫瑰色庫(kù)克菌對(duì)青霉素、阿奇霉素、克林霉素、慶大霉素、氧氟沙星、氟苯尼考和頭孢噻肟鈉等敏感，陰道加特納菌對(duì)頭孢噻肟鈉、克林霉素、氨芐西林鈉、氧氟沙星、阿奇霉素和慶大霉素等有敏感性。

3 討論

本試驗(yàn)中檢測(cè)乳房炎的發(fā)病率非常高，隱性乳房炎頭數(shù)陽(yáng)性率可達(dá)73.24%，乳區(qū)陽(yáng)性率達(dá)42.91%，比2008年李建軍報(bào)道新疆集約化牛場(chǎng)隱性乳房炎頭數(shù)陽(yáng)性率為64.75%、乳區(qū)陽(yáng)性率為36.6%有所增加。近幾年規(guī)?；B(yǎng)殖都有合理、配套的管理程序和規(guī)范，以及先進(jìn)配料和擠奶設(shè)備，為什么乳房炎的發(fā)病率有增無(wú)減呢？筆者采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，在本試驗(yàn)采樣中近10%臨床乳房炎陽(yáng)性牛，發(fā)病乳區(qū)所產(chǎn)的乳汁明顯不正常，但這樣的牛仍然出現(xiàn)在擠奶廳里，并且這樣的乳區(qū)還在正常機(jī)械化擠奶。患有乳房炎的牛繼續(xù)擠奶，除擠奶工本身的問(wèn)題外，還有監(jiān)管的問(wèn)題。因此，要加大對(duì)擠奶人員的技術(shù)培訓(xùn)，提高專(zhuān)業(yè)素質(zhì)；嚴(yán)格監(jiān)管，提高責(zé)任心；嚴(yán)格按擠奶程序進(jìn)行規(guī)范操作；及時(shí)檢查奶牛個(gè)體情況，及早發(fā)現(xiàn)隱性乳房炎給予治療；患乳房炎的奶牛嚴(yán)禁上廳擠奶，防止交叉感染。

如此高的乳房炎發(fā)病率嚴(yán)重影響奶牛生鮮乳的品質(zhì)。本試驗(yàn)中生鮮乳品質(zhì)分析，蛋白質(zhì)含量為2.87 g/100 g，雖然達(dá)到了我國(guó)最新奶業(yè)安全標(biāo)準(zhǔn)2.8 g/100 g， 但遠(yuǎn)低于發(fā)達(dá)國(guó)家氨醇單胞菌；B9、B10：奈瑟菌

3.0 g/100 g以上的標(biāo)準(zhǔn)，與歐美國(guó)家有很大差距。非脂乳固體為7.69 g/100 g，未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的8.1 g/100 g，密度為1.026 g/mL，也未達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的1.027 g/mL。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，我國(guó)生鮮乳品質(zhì)與歐美國(guó)家還有很大差距，因此，提高奶牛的飼喂?fàn)I養(yǎng)水平，加強(qiáng)乳品質(zhì)投入品的質(zhì)量；改善飼養(yǎng)管理和環(huán)境衛(wèi)生條件，嚴(yán)格控制和預(yù)防乳房炎的同時(shí)，也需要社會(huì)各界對(duì)奶牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供支持和幫助。

我國(guó)生鮮乳檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中還未將體細(xì)胞數(shù)列入檢測(cè)指標(biāo)。但國(guó)際奶牛聯(lián)合會(huì)規(guī)定，體細(xì)胞數(shù)在20萬(wàn)～40萬(wàn)/mL為隱型乳房炎，50萬(wàn)/mL以上為臨床型乳房炎[3]。目前我國(guó)也只有三元、光明、伊利等少數(shù)幾家大型乳業(yè)公司在收購(gòu)原料奶的時(shí)候要求控制體細(xì)胞數(shù)， 一般的要求是≤60萬(wàn)/mL[3]。本試產(chǎn)硫球鏈菌；i：奈瑟菌；j：陰道加特納菌。

驗(yàn)檢測(cè)平均生鮮乳體細(xì)胞在78.06萬(wàn)/mL，這也進(jìn)一步反映了奶牛乳房炎的嚴(yán)重性。如果按照體細(xì)胞數(shù)大于60萬(wàn)/mL為乳房炎計(jì)算，頭數(shù)乳房炎陽(yáng)性率可達(dá)60.56%，乳區(qū)乳房炎陽(yáng)性率達(dá)25.82%。控制體細(xì)胞的關(guān)鍵是控制乳房炎的發(fā)病率。在國(guó)外乳業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家，體細(xì)胞數(shù)是必檢指標(biāo)，并且都有強(qiáng)制的規(guī)定，比如歐盟、澳大利亞、新西蘭要求不超過(guò)40萬(wàn)/mL，美國(guó)要求不超過(guò)75萬(wàn)/mL。生鮮牛奶中平均體細(xì)胞數(shù)限量最低的國(guó)家是瑞士，約為10萬(wàn)/mL[4]。因此我國(guó)的牛奶體細(xì)胞數(shù)控制歷程還很?chē)?yán)峻。

本試驗(yàn)對(duì)10份有明顯癥狀的臨床乳房炎的乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離，10份乳樣均檢出細(xì)菌，細(xì)菌的檢出率為100%。根據(jù)菌落形態(tài)分離到8株菌，鑒定為無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和少動(dòng)鞘氨醇單胞菌3種菌。對(duì)10份經(jīng)CMT檢測(cè)陽(yáng)性的隱性乳房炎的乳樣進(jìn)行細(xì)菌分離，8份乳樣檢出細(xì)菌，細(xì)菌的檢出率為80%。而2份未分離到細(xì)菌，可能是因?yàn)樵撾[性乳房炎病原可能是支原體、衣原體或病毒等較難培養(yǎng)的微生物引起。根據(jù)菌落形態(tài)分離到10株菌，鑒定為8種菌。臨床乳房炎為乳房炎發(fā)病后期，病原菌較單一，為常見(jiàn)優(yōu)勢(shì)病原菌，而隱性乳房炎分離到細(xì)菌較復(fù)雜，沒(méi)有特定的優(yōu)勢(shì)菌。金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌是報(bào)道的常見(jiàn)乳房炎病原菌。本試驗(yàn)從隱性乳房炎中分離到的少動(dòng)鞘氨醇單胞菌[5-6]、溶血葡萄球菌[7-8]、玫瑰色庫(kù)克菌[9-10]、奈瑟菌[11]、陰道加特納菌[12]均有致病性的報(bào)道。雖然由于細(xì)菌生化鑒定儀VITEK-2 Compact 對(duì)口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌、西宮皮球菌和坐皮膚球菌兩兩不能區(qū)分菌種，但西宮皮球菌[13]、口腔鏈球菌和緩癥鏈球菌[14]也有相關(guān)的致病性報(bào)道。坐皮膚球菌和產(chǎn)硫球鏈菌相關(guān)文獻(xiàn)較少，是否有致病性，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，臨床乳房炎病原菌由于長(zhǎng)期使用抗生素治療，產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，而隱性乳房炎分離菌對(duì)大多數(shù)抗生素有敏感性，在早期治療過(guò)程中有很好的借鑒作用。文獻(xiàn)報(bào)道中隱性乳房炎病原菌主要有金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等[15-17]。本試驗(yàn)分離到隱性乳房炎細(xì)菌與報(bào)道的差異很大?？赡苁潜驹囼?yàn)確定的隱性乳房炎更接近發(fā)病初期，因此，所分離到的細(xì)菌均為醫(yī)院報(bào)道病原菌，在發(fā)展到臨床型乳房炎時(shí)被致病性更強(qiáng)的如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等所取代。本試驗(yàn)在臨床乳房炎中分離到金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌，但未分離到大腸桿菌，也可能是由于本試驗(yàn)樣品量較少所致。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉福榮，王守君，任仲麗，等. 奶牛乳房炎的病因與診治[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2013（11）：96.

[2]王傳蓉.奶牛乳房炎的病原體[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（12）：132，133.

[3] 云南省昆明數(shù)字鄉(xiāng)村新農(nóng)村建設(shè)信息網(wǎng). 各國(guó)對(duì)牛奶中體細(xì)胞數(shù)（SCC）的規(guī)定[EB/OL].[2014-09-12]. http：//www.ynszxc.gov.cn/S1/S2/C8507/DV/20130927/4302945.shtml.

[4]周承剛.牛奶體細(xì)胞檢測(cè)和控制的昨天、今天和明天[J]. 今日畜牧獸醫(yī)：奶牛，2012（10）：79-80.

[5]凌應(yīng)培.從血液中檢出少動(dòng)鞘氨醇單胞菌1例[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2010，28（1）：73.

[6]來(lái)漢江，楊莉俊，周鴻亮，等. 116例少動(dòng)鞘氨醇單胞菌的醫(yī)院感染及耐藥特點(diǎn)[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，20（4）：581-583.

[7]馬巧紅，陳群英.286株溶血葡萄球菌的臨床分布及藥敏分析[J]. 中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（9）：1079-1081.

[8]吳康明.32株溶血葡萄球菌感染分布及耐藥性監(jiān)測(cè)[J]. 安徽醫(yī)藥，2013，17（1）：101-102.

[9]楊 銳.玫瑰色庫(kù)克菌致手深部感染1例[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2010，8（3）：174.

[10]李世榮，王 紅，任愛(ài)民，等. 玫瑰色庫(kù)克菌致正常免疫力成人敗血癥1例[J]. 中國(guó)醫(yī)刊，2013，48（2）：109-110.

[11]劉鳳芹，黃 艷.2012年某院淋病奈瑟菌感染調(diào)查[J]. 中國(guó)感染控制雜志，2014，13（3）：189-190.

[12]張玉華.陰道加特納菌的致病性分析[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，8（9）：1125-1126.

[13]杜宏波，史卓敏，盧聯(lián)合.西宮皮球菌相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染一例[J]. 中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2010，4（3）：323-326.

[14]王虎軍，畢 磊，顧紅燕.緩癥鏈球菌感染的抗生素治療[J]. 浙江臨床醫(yī)學(xué)，2013，15（8）：1166-1168.

[15]王海軍，芮 藝，昌莉麗，等. 徐州地區(qū)奶牛隱性乳房炎病原調(diào)查及藥物敏感性檢測(cè)[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2012，44（12）：79-82.

[16]李建軍，楊學(xué)云，王治才，等. 新疆集約化奶牛場(chǎng)隱性乳房炎流行病學(xué)和病原學(xué)研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，45（2）：369-373.

[17]李樹(shù)梅，張海峰，盧勝明.河北地區(qū)隱性乳房炎的流行病學(xué)調(diào)查[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（1）：90-92.楊尚雪，李 珣，王曉曄，等. 水蛭素對(duì)冷凍前后豬精液中超氧化物歧化酶活性及mRNA表達(dá)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：275-278.endprint