王靜　喬飛　江雪飛　黨選民　詹園鳳

摘要：以同源二倍體、四倍體西瓜為試驗材料，對其葉片及葉片制備的原生質(zhì)體進行低溫處理，分別測定葉片電解質(zhì)外滲率、原生質(zhì)體細胞膜導(dǎo)水系數(shù)，分析不同倍性西瓜對亞低溫的耐受能力。結(jié)果表明：（1）將2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10溶于0.4 mol/L甘露醇中，于80 r/min下酶解120 min，西瓜葉片原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，制備效果最好；（2）四倍體西瓜原生質(zhì)體直徑為11.26 μm，比二倍體直徑為10.41 μm的高8.2%；（3）用電導(dǎo)法測西瓜葉片電解質(zhì)外滲率發(fā)現(xiàn)，-20、0 ℃處理時，二倍體西瓜的抗寒性略高于四倍體，但10～20 ℃的亞低溫范圍內(nèi)沒有檢出差異；（4）15～25 ℃的亞低溫處理原生質(zhì)體，測定細胞膜導(dǎo)水系數(shù)發(fā)現(xiàn)，二倍體導(dǎo)水系數(shù)的增幅極顯著小于四倍體，說明二倍體西瓜對亞低溫的耐受能力明顯高于四倍體。研究結(jié)果為植物種質(zhì)資源低溫抗性鑒定及多層次評價提供了新的研究思路和技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：西瓜；多倍體；低溫脅迫；原生質(zhì)體；導(dǎo)水系數(shù)

中圖分類號： S651.034 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0206-04

西瓜（Citrullus lanatus）起源于熱帶，為喜溫作物，極不耐寒，遇霜即死，屬于冷敏感植物，尤其在冬春反季節(jié)栽培的西瓜常會遇到低溫天氣導(dǎo)致其產(chǎn)量、品質(zhì)的下降[1]。近年來，隨著日光溫室、塑料大棚的大面積應(yīng)用，設(shè)施栽培西瓜幾乎很少出現(xiàn)0 ℃以下低溫凍害，偶爾會遭遇極端低溫冷害（0～8 ℃左右），但最常見的低溫逆境其實是亞低溫冷害。所謂亞低溫（也稱亞適溫或偏低溫）是指僅使作物生長緩慢但不使作物受到較大傷害而導(dǎo)致其生長停滯的溫度條件[2]。植物對亞低溫的耐受能力被稱為低溫耐受性，它與植物對冷害的抵抗能力即耐冷性之間既有聯(lián)系又相互區(qū)別[3-4]。大多起源于熱帶、亞熱帶的喜溫耐熱植物的亞低溫范圍在10～23 ℃[5-7]。

目前關(guān)于亞低溫對蔬菜的影響研究報道不多，袁偉、白潔發(fā)現(xiàn)，長時間亞低溫下，黃瓜表現(xiàn)出生長緩慢或停滯、花打頂、黃化、萎蔫、坐果率低、畸形瓜多、產(chǎn)量下降等[5，8]；王麗娟等研究得出，長期夜間亞低溫（15 ℃）改變了西紅柿光合產(chǎn)物分配方向[7]；Ventura等發(fā)現(xiàn)，只要設(shè)置適當(dāng)?shù)膩喌蜏?，果實質(zhì)量不但不會下降，反而會得到改良[6]。

有關(guān)同源多倍體西瓜抗性也已有多方面的研究[9-12]。郭啟高等試驗發(fā)現(xiàn)，四倍體西瓜耐熱能力明顯高于同源二倍體[12]。但亞低溫能否對西瓜產(chǎn)生影響，如果產(chǎn)生影響，會是什么樣的影響；不同倍性西瓜經(jīng)短時間亞低溫處理后，其低溫耐受性有何區(qū)別，這些都尚未見報道。

Lyons早就提出細胞膜系是低溫冷害發(fā)生的首要部位[13]，本研究以不同倍性西瓜葉片制備原生質(zhì)體，對其進行短時間的亞低溫處理，通過測定原生質(zhì)體的細胞膜導(dǎo)水系數(shù)、細胞電解質(zhì)外滲率分析不同倍性西瓜的低溫耐受能力，以期為西瓜多倍體抗性形成機制和抗性育種精確鑒定等方面提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以同源二倍體（FR-32-1B-2n）、四倍體（FR-32-1B-4n）西瓜為試驗材料，其中四倍體由同源二倍體通過秋水仙素誘導(dǎo)獲得。試驗材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 原生質(zhì)體制備方法的優(yōu)化：以二倍體和同源四倍體西瓜葉片為材料，設(shè)置2種酶液組合：酶1（2.7%纖維素酶+0.78% 離析酶R-10）、酶2（2.7%纖維素酶+0.78%離析酶R-10+0.155% 果膠酶），2種酶液組合均溶解在0.40 mol/L的甘露醇中；設(shè)置5個酶解時間：30、75、120、165、210 min；設(shè)置5個甘露醇濃度：0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mol/L，通過測定不同處理原生質(zhì)體產(chǎn)出率等綜合篩選最佳制備方法。

不同倍性西瓜葉片細胞大小的比較：以制備好的原生質(zhì)體為試驗材料，采用顯微照相，AxioVision Re1.4.8軟件測量原生質(zhì)體直徑，比較不同倍性西瓜細胞直徑的差異。

不同倍性西瓜低溫耐受性比較：（1）以制備好的原生質(zhì)體為試驗材料，對其進行短時間的亞低溫處理，處理溫度分別設(shè)為15、20、25 ℃（25 ℃為對照，CK），處理時間為15 min，通過測定并計算細胞膜導(dǎo)水系數(shù)（Lp）評價不同倍性西瓜低溫耐受性。（2）以西瓜葉片為試驗材料，對其進行低溫處理，處理溫度設(shè)為-20、0、10、15、20、25 ℃（25 ℃為對照，CK），處理時間為30 min，通過電導(dǎo)法測定其相對電解質(zhì)外滲率，評價不同倍性西瓜低溫耐受性。試驗均設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 試驗方法 原生質(zhì)體的制備：取西瓜完全展開的葉片，切成5 mm2左右的塊狀，稱取1 g葉片，加入5 mL酶解液混勻，于25 ℃、80 r/min搖床上振蕩酶解。酶解后的溶液用160目的尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液。用0.4 mol/L甘露醇清洗，定容至6 mL，于400 r/min下離心5 min，棄上清，重復(fù)1次。為降低細胞壁的再生對測定細胞膜導(dǎo)水系數(shù)的影響，在已制備出的原生質(zhì)體懸浮溶液中加入酶液（1% 纖維素酶、0.3% 離析酶R-10，溶于0.4 mol/L甘露醇），加入量為懸浮液 ∶ 酶液=15 ∶ 1。

原生質(zhì)體產(chǎn)出率的測定：采用血球計數(shù)板計數(shù)法測定，吸取20 μL稀釋后的原生質(zhì)體懸浮液滴在血球計數(shù)板上，然后置于10×物鏡顯微下觀察（Zeiss，M1）計數(shù)，n≥200，重復(fù)3次，取平均值。

原生質(zhì)體初始直徑測定：取制備好的原生質(zhì)體滴在血球計數(shù)板上顯微觀察照相，樣本數(shù)n≥30個/次，重復(fù)3次，然后用AxioVision Re1.4.8軟件對原生質(zhì)體直徑進行測定，每個重復(fù)測定30個原生質(zhì)體，取平均值。endprint

細胞膜導(dǎo)水系數(shù)測定：細胞膜導(dǎo)水系數(shù)的測定參考Liu等的方法[14]。具體如下：取制備好的原生質(zhì)體20 μL，加入等體積水混合，即開始計時（t=0）；迅速將混合液轉(zhuǎn)移至血球計數(shù)板上，再在40×物鏡下分別于90、150 s照相；通過測量原生質(zhì)體直徑的變化計算原生質(zhì)體體積的變化，再用以下公式計算細胞膜導(dǎo)水系數(shù)：

Lp=dV/dtSΔΨw≈（V150 s-V90 s）/60 sSΔosm

。

式中：ΔΨw為水勢的變化值；V90 s為90 s時原生質(zhì)體的體積，μm3；V150 s為150 s時原生質(zhì)體的體積，μm3；Δosm為加水混勻前后滲透勢的差值，mmol/kg，滲透勢由WESCOR 5600滲透勢儀測定；S為原生質(zhì)體的表面積，μm2。

西瓜葉片相對電解質(zhì)外滲率測定：參考史樹德等的測定方法[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶組合在不同酶解時間下對原生質(zhì)體制備的影響

由圖1可以看出，2種酶液組合均可制備獲得西瓜葉片原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)率均隨著酶解時間的延長呈先升高后降低的趨勢。酶解時間不同，原生質(zhì)體產(chǎn)率差異很大，經(jīng)方差分析，2種酶液組合的最佳酶解時間都在120～165 min范圍內(nèi)，<120 min或>165 min原生質(zhì)體產(chǎn)率都極顯著降低。

2種酶液組合的變化一致，但變化幅度并不一樣，酶1的上升幅度和下降幅度均大于酶2，且酶1組合的原生質(zhì)體最高產(chǎn)率可達1.28×105個/mL，比酶2高15.4%。由此可知，選用酶1組合，在酶解120 min下制備西瓜葉片原生質(zhì)體既省時產(chǎn)出率又高。

2.2 不同甘露醇濃度對原生質(zhì)體制備的影響

去除細胞壁后的原生質(zhì)體需要一個合適的滲透環(huán)境才能維持正常形態(tài)。Cochrane等研究發(fā)現(xiàn)，甘露醇在水中的濃度和滲透勢有著較好的線性關(guān)系[16]，所以將甘露醇作為滲透調(diào)節(jié)劑在很多研究中都有應(yīng)用。由圖2可知，甘露醇濃度對西瓜葉片原生質(zhì)體產(chǎn)率有較大影響，濃度過低或過高都會降低原生質(zhì)體的產(chǎn)率。當(dāng)甘露醇濃度為0.40 mol/L時，原生質(zhì)體產(chǎn)率最高，且經(jīng)方差分析，與0.30、0.50 mol/L處理的差異達到極顯著水平，說明0.40 mol/L甘露醇最有利于西瓜葉片原生質(zhì)體的形成。因此，本研究的西瓜原生質(zhì)體制備方法優(yōu)化為：酶1組合（2.7% 纖維素酶+0.78% 離析酶 R-10）溶于0.4 mol/L甘露醇中，于80 r/min下酶解120 min，西瓜葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)出率最高，制備效果最好（圖3）。

2.3 不同倍性西瓜葉片細胞直徑的比較

多倍體與普通二倍體西瓜相比，不僅染色體數(shù)量增加，大多還表現(xiàn)出細胞體積增大或某些器官的巨型化，例如花瓣、果實或種子等器官的大型化。本試驗選用的四倍體西瓜（FR-32-1B-4n）的葉片就比其同源二倍體（FR-32-1B-2n）的葉片大，但是其葉片大是由于葉片中細胞的體積較大還是細胞數(shù)量較多引起的并不清楚。本研究通過比較不同倍性西瓜葉片原生質(zhì)體的直徑分布（圖4）可知，二倍體西瓜葉片原生質(zhì)體的平均直徑為10.41 μm，分布在8.0～10.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的40%，分布在10.0～14.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的60%；四倍體的平均直徑為 11.26 μm，分布在8.0～10.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)約占總數(shù)的22.9%，分布在10.0～14.0 μm之間的原生質(zhì)體數(shù)占總數(shù)的71.4%，另外還有5.7%的分布在14.0～16.0 μm范圍內(nèi)。由此可知，細胞個體增大是四倍體西瓜葉片巨型化的重要原因之一。

2.4 低溫處理對不同倍性西瓜葉片相對電導(dǎo)率的影響

從Dexter將電導(dǎo)法應(yīng)用于生物抗寒性鑒定[17]以來，人們已公認此方法較可靠。由圖5可以看出：（1）處理溫度與西瓜葉片相對電導(dǎo)率間有較好的相關(guān)關(guān)系，即在-20～25 ℃范

圍內(nèi)，溫度越低，其西瓜葉片的相對電導(dǎo)率越大，表明西瓜葉片細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲的越多，細胞膜受傷害程度越大；（2）不同倍性西瓜在同一溫度處理下的相對電導(dǎo)率差異不大，只有-20、0 ℃處理能看出四倍體西瓜葉片的相對電導(dǎo)率稍高于二倍體，而10～20 ℃的亞低溫范圍內(nèi)，兩者的相對電導(dǎo)率幾乎重疊在一起，沒有顯著差異。二倍體和四倍體西瓜對亞低溫的耐受性是否真的沒有差異，對此我們進一步用細胞膜導(dǎo)水系數(shù)法進行分析。

2.5 亞低溫處理對不同倍性西瓜細胞膜導(dǎo)水系數(shù)的影響

低溫逆境下，植物對水分的吸收、運輸受限[18]，而細胞體積的迅速變化可以通過原生質(zhì)體來觀察[14]。如圖6所示，將原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移到低滲透勢的溶液中，原生質(zhì)體體積會逐漸變大，而其增大的速度可以通過細胞膜導(dǎo)水系數(shù)（Lp）來表示。本研究表明，15、20 ℃亞低溫處理后，同源二倍體和四倍體西瓜原生質(zhì)體的Lp明顯比對照（25 ℃）的Lp有大幅提高，但二者的增幅不同，經(jīng)方差分析，四倍體的原生質(zhì)體細胞膜導(dǎo)水系數(shù)的增幅（ΔLp）極顯著高于同源二倍體的（圖7）。由此也可看出，亞低溫處理下，二倍體西瓜原生質(zhì)體的Lp表現(xiàn)出比四倍體更好的穩(wěn)定性，即二倍體西瓜對亞低溫逆境有更好的耐受能力。

3 結(jié)論與討論

多倍體育種在西瓜中極其普遍，生產(chǎn)上常見的有二倍體、三倍體和四倍體。劉文革等研究發(fā)現(xiàn)，西瓜染色體經(jīng)加倍后，其抗逆性也會發(fā)生改變[19]。這在其他多倍體物種中也普遍存在，如杜鵑和黑麥草的同源四倍體就比二倍體適應(yīng)性更強，

但其耐冷性卻較差[20-21]?？墒墙?jīng)過抗逆鍛煉后，不同倍性材料的抗性提高程度表現(xiàn)不同。如經(jīng)低溫鍛煉后，四倍體西瓜幼苗細胞膜保護酶SOD、POD活性較高，比二倍體表現(xiàn)出更加耐冷[22]。以上研究表明，同源多倍體抗性形成可能存在多種機制。

細胞膜作為植物內(nèi)部與外界環(huán)境交流的界面，對逆境最為敏感[18]。低溫可對細胞膜造成直接物理損傷從而導(dǎo)致細胞內(nèi)電解質(zhì)外滲，滲漏的多少可以體現(xiàn)損傷程度，滲漏的多少可以用Dexter等提出的電導(dǎo)率儀法[17]測定。目前，該方法結(jié)合Logistic方程還可以進一步定量確定植物組織的半致死溫度（LT50），抗熱性[23]和抗寒性[24]。本研究應(yīng)用該方法測定不同低溫條件下，同源二倍體和四倍體西瓜葉片電解質(zhì)滲漏的情況時，發(fā)現(xiàn)該方法能較好地區(qū)分不同處理溫度時的樣品電解質(zhì)的滲漏情況，但是不能區(qū)分不同倍性西瓜的電解質(zhì)的滲漏差異，特別是在亞低溫（10～20 ℃）范圍內(nèi)。但通過測定原生質(zhì)體的細胞膜導(dǎo)水系數(shù)卻能明顯區(qū)分，且差異達到了極顯著水平（P<0.01）。由此表明，細胞膜導(dǎo)水系數(shù)或許可用于植物亞低溫下低溫耐受能力的分析。endprint

通過原生質(zhì)體體積變化測定細胞膜導(dǎo)水系數(shù)涉及各種生理過程。在原生質(zhì)體體積快速增大或縮小的情況下，細胞膜的表面積在幾秒鐘內(nèi)就表現(xiàn)出明顯變化，而細胞膜面積的迅速增大與囊泡運輸、細胞骨架等多種亞細胞結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)[14，25]，說明染色體加倍后細胞自身生理調(diào)節(jié)機制也發(fā)生了變化。

本研究優(yōu)化了不同倍性西瓜葉片原生質(zhì)體的制備方法，同時從細胞膜導(dǎo)水系數(shù)和細胞膜傷害率2個方面對不同倍性西瓜的低溫耐受能力進行了分析。這些結(jié)果為研究多倍體西瓜抗性提供了新的思路，為西瓜抗性的多層次評價提供了技術(shù)參考。

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