郭建偉　羅冰　楊麗芬　楊建　田學(xué)軍　劉艷紅　胡銳菊

摘要：以草果果腐病鐮刀菌作為指示菌篩選拮抗產(chǎn)芽孢細(xì)菌，結(jié)果表明健康果實(shí)比患病果實(shí)的細(xì)菌多樣性高，但相對(duì)抑制率≥35%的高拮抗菌株均分離自病果，并通過(guò)形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定出8株枯草芽孢桿菌、1株解淀粉芽孢桿菌、1株嗜堿芽孢桿菌、1株花園芽孢桿菌、1株苛求芽孢桿菌及3株革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢球菌。

關(guān)鍵詞：鐮刀菌；產(chǎn)芽孢細(xì)菌；草果生物防治

中圖分類號(hào)： S432.4+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）10-0176-03

草果（Amomum tsaoko Crevost et Lemaire），又名草豆蔻，多年生常綠叢生草本植物，隸屬姜科豆蔻屬，主要分布我國(guó)云南、廣西和貴州等?。▍^(qū)）局部地區(qū)；果實(shí)性溫、濃香，具有健胃、消食、順氣、祛寒濕等藥效，也是上好的烹調(diào)佐料[1]。云南南部、東南部和西南部的亞熱帶雨林種植廣泛，萎蔫病、葉斑病、疫病等常見病害日益引起研究者的關(guān)注[2-4]；另?yè)?jù)本團(tuán)隊(duì)調(diào)查，花腐病、果腐病、立枯病在云南紅河州的屏邊、元陽(yáng)、綠春均有暴發(fā)，其中果腐病已遍及文山、紅河、綠春、金屏、屏邊多個(gè)縣（區(qū)）的草果產(chǎn)區(qū)，常導(dǎo)致果穗腐爛、脫落，果實(shí)腐爛，葉片枯死，其病原菌為鐮刀菌（Fusarium sp.）。

產(chǎn)芽孢細(xì)菌，尤其是藥用植物內(nèi)生菌在植物病害生物防治和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值[5]；這類細(xì)菌突出的特征是能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢，有利于生防菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及在環(huán)境中存活、定殖與繁殖[6]；目前應(yīng)用廣泛的產(chǎn)芽孢細(xì)菌種類有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilies）、多黏芽孢桿菌（B.polymyxa）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、蠟狀芽孢桿菌蕈狀變種（B. cereus var. mycoides）等[7]。因而，本研究擬從草果根際土壤及果實(shí)分離耐高溫（80 ℃恒溫處理30 min）細(xì)菌，繼而篩選對(duì)果腐病鐮刀菌具有高拮抗活性的菌株，再進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定，重點(diǎn)篩選芽孢桿菌為后續(xù)生防菌劑的開發(fā)提供菌株來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

病原菌：草果果腐病鐮刀菌（Fusarium sp.）菌株F1。

供試土樣及草果果實(shí)：供試土樣于2011年10月采自云南省紅河州金屏縣馬鞍底鄉(xiāng)草果種植區(qū)的患病植株根際，以無(wú)菌鏟子刮去表層土壤，每個(gè)樣點(diǎn)取15～30 cm深度的草果根際土30 g；供試草果果實(shí)于2012年7—8月采自屏邊縣石寨村、白沙村、倉(cāng)房村、新現(xiàn)村及蒙自市崗壇子。

培養(yǎng)基：PDA、LB、硝酸鹽還原試驗(yàn)培養(yǎng)基、淀粉水解試驗(yàn)培養(yǎng)基、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基、西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基、牛奶培養(yǎng)基等[8]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐高溫細(xì)菌的分離、純化 土樣細(xì)菌分離：將土壤樣品磨碎、混勻、過(guò)篩（100目），每份樣品取2 g細(xì)土樣放入盛有18 mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，120 r/min室溫振蕩1 d，使土樣分散并與水混合，置于80 ℃水浴30 min以殺死微生物菌體和其他雜菌保留芽孢[9]。熱處理后靜置 5 min，吸取1 mL土壤懸液加入盛有9 mL無(wú)菌水的大試管中充分混勻，再吸取1 mL加入另一盛有9 mL無(wú)菌水的大試管中搖勻，以此類推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5等不同稀釋度的土壤溶液[8]。取各梯度土壤懸液涂布于LB培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度3次重復(fù)，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌的分離：剪取健康草果或果腐病病果的健康部位，采用郭建偉等的方法[9]進(jìn)行表面消毒，即先以75%乙醇消毒5 min，再轉(zhuǎn)入10%次氯酸鈉溶液中消毒8 min，沖洗2～3遍后用無(wú)菌剪刀剪取5 g，放入研缽中加入少量無(wú)菌水、石英砂快速研磨，研磨之后放入無(wú)菌燒杯中加20 mL無(wú)菌水溶解，置于80 ℃水浴30 min[10]。熱處理后靜置5 min，取上清液30 μL稀釋100倍（相當(dāng)于總共稀釋500倍）后取30 μL涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，每份樣品3個(gè)重復(fù)，置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

純化：待長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落邊沿是否整齊、光滑、中央是否突起、正反面顏色挑取不同的菌體劃線，35 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后根據(jù)菌落形態(tài)及鏡檢菌體形態(tài)確定是否為純菌落，若不純則繼續(xù)劃線分離。

1.2.2 根腐病拮抗菌株的篩選 將細(xì)菌純菌株以三點(diǎn)接種法與病原菌接在加有蛋白胨的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d；測(cè)量抑菌圈半徑（抑菌圈半徑是病原菌菌落半徑減去病原菌接種點(diǎn)到凹痕的距離），以不接種細(xì)菌的平板作對(duì)照測(cè)量病原菌半徑，根據(jù)測(cè)量結(jié)果計(jì)算相對(duì)抑菌率（相對(duì)抑菌率=抑菌圈半徑/病原菌半徑×100%）[11]。

1.2.3 根腐病高拮抗菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 對(duì)相對(duì)抑菌率≥35%的拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、耐鹽、耐高溫、V.P試驗(yàn)、厭氧性試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)等形態(tài)觀察及生理生化特征鑒定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高溫細(xì)菌的分離

從采集自不同地方的草果果實(shí)及土壤樣品中經(jīng)80 ℃處理、稀釋涂布、劃線培養(yǎng)等方法共分離純化得到208株細(xì)菌。由表1可見，健康果實(shí)比病果的細(xì)菌數(shù)量更為豐富；細(xì)菌分布具有一定的地方差異性，屏邊縣白沙村健康果實(shí)、病果的細(xì)菌多樣性最高，新現(xiàn)村健康果實(shí)、病果的細(xì)菌多樣性最低。

2.2 根腐病拮抗菌株的篩選

經(jīng)對(duì)峙培養(yǎng)法，從208株細(xì)菌中篩選出35株具有一定抑菌活性的菌株，其中屏邊石寨村草果果實(shí)細(xì)菌中篩選到8株拮抗菌，6株相對(duì)抑菌率≥35%；白沙村篩選到7株拮抗菌，3株相對(duì)抑菌率≥35%；新現(xiàn)村篩選到2株拮抗菌，1株相對(duì)抑菌率≥35%；倉(cāng)房村篩選到5株拮抗菌，2株相對(duì)抑菌率≥35%；蒙自崗壇子村草果果實(shí)細(xì)菌篩選到5株拮抗菌，2株相對(duì)抑菌率≥35%；金平縣馬鞍底鄉(xiāng)果梗、果實(shí)均感染果腐病鐮刀菌的根際土壤細(xì)菌中篩選到8株拮抗菌，相對(duì)抑菌率均低于35%（表2）。相對(duì)抑菌率≥35%的拮抗菌株均分離自患病草果果實(shí)，可能因?yàn)榻】挡莨麡悠份^少、細(xì)菌多樣性高但優(yōu)勢(shì)種群少，不利于拮抗菌株的篩選。endprint

2.3 果腐病高拮抗菌株的鑒定

參照文獻(xiàn)[8]，經(jīng)形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定，PSB-1、PSB-2、PSB-13、PSB-17、PBB-11、PCB-9、PCB-10、MGB-6等8株菌為枯草芽孢桿菌（B. subtilis），PBB-19初步鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），PSB-8初步鑒定為嗜堿芽孢桿菌（B. alcalophilus），MGB-7初步鑒定為花園芽孢桿菌（B. horti），MGB-16初步鑒定為苛求芽孢桿菌（B. fastidious）；另有PSB-31、PBB-12、PXB-14 等3株菌，均產(chǎn)圓形或橢圓形芽孢，革蘭氏陽(yáng)性、接觸酶、硝酸鹽還原、V. P反應(yīng)、淀粉水解、酪素水解均為陽(yáng)性，能耐5% NaCl及40 ℃以上高溫，除PXB-14檸檬酸鹽反應(yīng)陰性外其余2株為陽(yáng)性，僅能鑒定到革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢球菌（如表3所示），具體屬、種分類地位尚須進(jìn)一步研究。

本研究以80 ℃處理30 min篩選草果果腐病產(chǎn)芽孢拮抗菌，篩選到的15株相對(duì)抑制率≥35%的拮抗菌株均能產(chǎn)芽孢，表明這種篩選產(chǎn)芽孢細(xì)菌的方式是有效的。

3 結(jié)論與討論

內(nèi)生菌定植于植物組織內(nèi)部不易受環(huán)境條件影響而成為重要的微生物農(nóng)藥、增產(chǎn)菌，根際微生物是定殖于植物根際能直接或間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)的微生物[12]。由于草果在根際萌花并結(jié)果，草果果實(shí)極易受到周圍及根際土壤、果實(shí)表面微生物的影響，因而本研究為擴(kuò)大篩選防治草果果腐病并利于加工生防菌劑的菌株來(lái)源，選擇健康及患病草果、病株根際土壤篩選耐高溫細(xì)菌，從13份樣品中共篩選到208株細(xì)菌，35株對(duì)果腐病鐮刀菌具有一定的室內(nèi)抑制作用，其中相對(duì)抑制率≥35%的有15株，經(jīng)鑒定均能產(chǎn)芽孢，大部分屬于芽孢桿菌屬甚至枯草芽孢桿菌，這與陳波等的研究結(jié)果[13]基本一致但有所差異。差異的原因可能在于：一是采樣地點(diǎn)環(huán)境及管理的差異性，本研究中草果種植于保留松樹等部分山林樹種或具有人工栽培旱冬瓜作為遮陰植物的山坡，與同因鐮刀菌引起的香蕉種植園相比排水性好卻極少施肥，對(duì)土壤微生物及草果果實(shí)內(nèi)生、附生微生物種群的人為干擾較少；二是分離樣品的差異性，本研究采用草果果實(shí)、病株根際土壤分離耐高溫拮抗微生物，比后者香蕉健康及枯萎病植株根際細(xì)菌的豐度高但排除了葡萄球菌屬等不產(chǎn)孢細(xì)菌類群。在產(chǎn)芽孢細(xì)菌的分離技術(shù)方面與王松等的研究[5]相比，本研究先采用高溫處理去除其他非產(chǎn)芽孢細(xì)菌的干擾，分離效率更高，但后者在分離細(xì)菌后進(jìn)行芽孢染色觀察排除非產(chǎn)芽孢細(xì)菌的干擾，也提高了分離效率，若結(jié)合2種處理篩選拮抗產(chǎn)芽孢細(xì)菌，可能分離效率更高。

PSB-8、PSB-13、PBB-12、PCB-10、MGB-7、MGB-16對(duì)草果果腐病鐮刀菌的相對(duì)抑菌率均大于60%，除PBB-12外均屬于芽孢桿菌屬，而PBB-12屬于革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)芽孢球菌，既具有高拮抗性又都具有可抗逆境的芽孢，便于開發(fā)抗逆性強(qiáng)、耐貯存的生防菌劑，因而均具有較好的應(yīng)用前景。有研究表明大量的根際有益微生物具有固氮、解磷、產(chǎn)生植物激素等促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治病害的能力，內(nèi)生細(xì)菌主要為兼性內(nèi)生的土壤細(xì)菌，目前還不清楚其促生長(zhǎng)機(jī)制是單個(gè)微生物還是多種微生物類群的作用[14]。本研究雖未從病株根際土壤篩選到高拮抗性的產(chǎn)芽孢細(xì)菌，但數(shù)量多達(dá)8株，因而根際土壤拮抗產(chǎn)芽孢細(xì)菌也具有一定的應(yīng)用潛能。

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