吳文嬙+韋永選+周鑫+黃小龍+許云+黃東益

摘要：炭疽病是大薯生產(chǎn)上最嚴重的病害，迫切需要可靠的方法來篩選抗病種質(zhì)。采用薯蕷上分離到的2份炭疽病菌株SY01、DJ01的分生孢子對大薯Da87、Da115的組培苗進行接種，通過對病情指數(shù)的比較分析最佳的接種方法。結(jié)果表明：大薯Da87、Da115對炭疽菌的抗性差異極顯著，菌株SY01、DJ01之間致病力差異極顯著；在篩選的接種方法中，最佳的為使用3×106個/mL孢子濃度的涂抹法。

關鍵詞：大薯；炭疽病；接種方法；病情指數(shù)；抗病評價

中圖分類號：S436.32 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）10-0174-02

薯蕷家族廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，大薯被公認為是薯蕷中分布最廣、最多的種[1]。大薯（Dioscorea alata）別稱參薯、腳板薯、菜山藥，為薯蕷屬單子葉藤本植物，在我國長江以南地區(qū)均有種植，是四大薯類作物中營養(yǎng)最豐富的作物，在非洲一些國家是僅次于木薯的主糧。

炭疽病發(fā)病可從苗期開始一直到采收，嚴重影響大薯的生長及薯塊的產(chǎn)量。來自加勒比、南太平洋、西非和印度等國家和地區(qū)的統(tǒng)計結(jié)果表明，該病嚴重時導致產(chǎn)量下降90%，幾種常見的栽培種都缺乏抗性[2-3]。炭疽?。z孢炭疽菌）引起葉片壞疽并且藤蔓枯萎，導致光合作用表面積的下降并且伴隨著薯蕷塊莖產(chǎn)量的下降。在塊莖形成前或者是形成期間病害的流行對塊莖產(chǎn)量的影響是極大的。炭疽病可發(fā)生在全株，包括葉片、藤蔓、薯塊，帶病的種薯、土壤會持續(xù)影響，甚至導致絕種[4]。在我國南方地區(qū)，高溫多雨的天氣更有利于大薯炭疽病的發(fā)生和發(fā)展。在法國西部和尼日利亞侵染薯蕷類作物的炭疽病病原菌表現(xiàn)出遺傳性和致病性的明顯差異[5-8]。國內(nèi)外大多采用離體葉片進行抗性鑒定，筆者經(jīng)過多年研究發(fā)現(xiàn)該法并未能完全反映種質(zhì)的抗性水平且重復性比較差。由于大薯在種植時主要采用薯塊育苗，進行苗期抗性鑒定需要大量的薯塊，且生產(chǎn)周期上無法滿足準確可靠的抗病性鑒定的試驗要求。用組培苗進行大量基因型的快速篩選對于膠孢炭疽菌的毒力和侵染力的分析是精確有用的[9]，組培苗還可用于栽培種-分離物互作的研究和研究侵染進程[10-11]。更進一步，組培苗可用于評價栽培種對特定分離物的反應。這些對于非當?shù)氐哪z孢炭疽菌的篩選和國家交流項目的薯蕷評價是可行的[12]。因此，本研究欲采用已分離鑒定的炭疽病菌對大薯組培苗進行抗性鑒定，篩選最佳的接種方法。目前，筆者所在課題組已經(jīng)收集了我國南方地區(qū)160份的大薯種質(zhì)資源，建立了我國的薯蕷種質(zhì)資源圃，分離鑒定了100株來自薯蕷的炭疽病菌株，建立快速有效的苗期抗性鑒定方法對于我國大薯抗性種質(zhì)資源的篩選十分必要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：DJ01（分離自海南儋州大薯）、SY01（分離自海南?？谏剿帲?；供試大薯：Da87、Da115；盆栽基質(zhì)：營養(yǎng)土 ∶ 陶粒 ∶ 草木灰=3 ∶ 1 ∶ 1。

1.2 試驗方法

1.2.1 大薯組培苗的獲得 以幼嫩的大薯實生苗的單個帶節(jié)莖段為外植體，經(jīng)自來水沖洗30 min，用75%乙醇浸泡15 s，選用0.1%HgCl2處理8～10 min，再用無菌水洗3～5次。將消毒好的帶芽莖段接種到培養(yǎng)基（MS+3%蔗糖+03%植物凝膠，pH值5.8）中。無菌苗培養(yǎng)2個月，選擇長出5～8張葉且已生根的材料進行煉苗。煉苗1周后移栽至營養(yǎng)缽，待植株葉片開始恢復生長后進行接種。

1.2.2 接種菌孢子的制備 先將菌種接在PDA 平板上進行活化，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，經(jīng)過過濾純化后收集孢子配置懸浮液。采用血球計數(shù)板計數(shù)法將供試菌株的孢子懸浮液分別配制成3個濃度：3×105、 3×106、3×107個/mL。

1.2.3 接種方法 接種采用噴霧法、多針接種法、涂抹法進行試驗。采用2種菌株接種2種大薯種質(zhì)，分別用上述3種濃度處理，每個處理10株苗，設置3株接種水作為對照，試驗重復3次。接種時室溫為（26±2） ℃，用塑料薄膜覆蓋，黑暗保濕2 d，之后揭開覆蓋，自然光照下培育。接種12 d后開始調(diào)查發(fā)病情況及統(tǒng)計病情指數(shù)。

1.2.4 病葉分級 大薯炭疽病室內(nèi)苗期抗病性調(diào)查分級標準：0級，無癥狀；1級，病斑直徑0～1.0 mm，有1～2張葉發(fā)??；2級，病斑直徑在11～20 mm，有2張真葉發(fā)病，或有少數(shù)大斑；3級，病斑直徑在21～30 mm，并產(chǎn)生孢子，或有2張以上葉片發(fā)病，病株出現(xiàn)落葉，株形不正常；4級，有許多大斑，大量產(chǎn)生孢子，病株大量落葉，近枯死或枯死。

（1）病情指數(shù)。將參試品種的發(fā)病級別按病情指數(shù)計算式換算成該種質(zhì)的病情指數(shù)，換算公式如下：病情指數(shù)（DI）=∑（株數(shù)×病級數(shù)）/（總株數(shù)×最高病級數(shù)）×100。

（2）抗病性評價標準。薯蕷種質(zhì)炭疽病抗性鑒定分為6個等級[13]：1級，免疫（immune，I），DI=0；2級，高抗（highly resistant，HR），080。

1.2.5 菌株致病性分級 菌株致病性類型劃分標準如下[14]：強（A）：平均病情指數(shù)40.1～ 100.0；中（B）：平均病情指數(shù) 20.1～ 40.0；弱（C）：平均病情指數(shù)0.1～20.0；無致病力（D）：平均病情指數(shù)為0。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SAS軟件進行Duncanss測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 大薯種質(zhì)的炭疽病抗性鑒定

不同處理下大薯種質(zhì)的病情指數(shù)均值（表1）表明：大薯種質(zhì)Da115、Da87對炭疽病的抗性為中感（MS），Da115、Da87的病情指數(shù)差異極顯著，Da115較Da87更易感病。

2.2 薯蕷炭疽菌菌株的致病力檢測

由表2不同處理下薯蕷炭疽菌菌株致病后引起的病情指數(shù)均值表明：薯蕷炭疽菌菌株DJ01、SY01的致病性為中致病性，二者的致病力差異極顯著，菌株DJ01的致病力較強。

2.3 不同接種菌液孢子濃度和不同接種方法對大薯炭疽病發(fā)病情況的影響

表3的2份炭疽菌菌株的3種孢子濃度接種2份大薯種質(zhì)后的病情指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果表明：多針接種法和涂抹法的不同孢子濃度接種后病情指數(shù)差異均達到了極顯著水平；噴霧法的孢子濃度水平為 3×105、3×106個/mL之間差異未達到極顯著水平。當孢子濃度水平為3×105個/mL時，涂抹法和噴霧法的病情指數(shù)較低，且差異不顯著，未達到大薯種質(zhì)病情指數(shù)的均值，不適于進行抗病性鑒定。當孢子濃度水平為3×106、3×107個/mL時，3種接種方法的病情指數(shù)差異均達到了極顯著水平。綜合來看，多針接種法發(fā)病早，病情指數(shù)均高于2份大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和2份炭疽菌菌株的平均致病力，當孢子濃度水平為3×107個/mL時病情指數(shù)均值高達90.26，接近死亡，因此多針接種法不適合用于大薯種質(zhì)的抗病性鑒定。噴霧法總體的病情指數(shù)較低，需要較高的孢子濃度才能達到適合的病情指數(shù)。當孢子濃度為3×106個/mL時，涂抹法的病情指數(shù)與大薯種質(zhì)的平均病情指數(shù)和炭疽菌平均致病力較一致。因此最佳的接種方法為涂抹法，孢子濃度水平為3×106個/mL。

3 結(jié)論與討論

目前，活體接種的結(jié)果能較充分地反映植株對病原菌的抗性，室內(nèi)接種鑒定方法的研究能為抗性種質(zhì)篩選提供可靠的依據(jù)。Onyeka等用3份大薯炭疽菌分離物（膠孢炭疽菌）來評價60份大薯栽培種的組培苗反應，認為組培苗提供了用于評價大量大薯種質(zhì)的快速、可靠和健全的方法，可進一步用于田間的測試，這項技術降低了大量株系所需要的大面積土地[12]。Akem用噴霧法接種大薯抗病種質(zhì)Dan087、TDa86/00620、TDa316以及感病種質(zhì)TDa85/00257、TDa86/00607、TDa85/00250進行致病性試驗，每個植株用2mL孢子濃度為1.6×106個/mL的孢子懸浮液噴霧接種，28 d后觀察并記錄植株的感病情況[15]。炭疽病菌孢子雖然是接種在活體植株上，但是發(fā)病周期較長。陳吉良采用大薯和山藥的離體葉片進行菌株致病性鑒定和植株的抗性初篩，初篩結(jié)果往往與田間的抗性鑒定不一致，這可能與田間環(huán)境有較大差異相關，也可能是離體葉片與活體植株的差異導致的[16]。本試驗中對于同一份材料的抗病等級是基于不同處理下病情指數(shù)的均值，在3種接種方法中基于這個均值進行衡量，多針接種法發(fā)病快、發(fā)病較嚴重，但是較難比較種質(zhì)之間的抗性差異；噴霧法發(fā)病較慢，需要較多的孢子進行侵染；相比之下，涂抹法較適中。在3種孢子濃度侵染時，孢子濃度為3×105個/mL時，僅在多針接種法中表現(xiàn)出較高的病情指數(shù)，而在涂抹法和噴霧法中均表現(xiàn)為較低的病情指數(shù)；濃度為3×106個/mL時，多針接種法有較高的病情指數(shù)，而噴霧法有較低的病情指數(shù)，涂抹法較適宜；濃度為3×107個/mL時，多針接種法接種的植株接近死亡，適宜用涂抹法和噴霧法。因此，本研究表明，當孢子濃度水平為3×106個/mL時，涂抹法最適宜大薯組培苗的抗病性鑒定。

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